[发明专利]一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法在审
| 申请号： | 202110642739.2 | 申请日： | 2021-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN113355347A | 公开（公告）日： | 2021-09-07 |
| 发明（设计）人： | 王永中;彭慧;盛康亮;汪静敏;孔小卫 | 申请（专利权）人： | 安徽大学 |
| 主分类号： | C12N15/80 | 分类号： | C12N15/80;C12N15/65;C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 北京力量专利代理事务所(特殊普通合伙) 11504 | 代理人： | 徐冬 |
| 地址： | 230601 安徽省*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 g418 少孢节丛孢菌中 遗传 转化 筛选 体系 建立 方法 | ||
1.一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用少孢节丛孢菌密码子偏好性对G418基因序列进行手动优化，优化后的G418基因序列为SEQ ID No.1；
(2)将上述优化后的G418基因序列5’加上Ptef启动子序列，3’加上Ttef终止子序列，获得Ptef-G418-Ttef的DNA序列；
(3)将上述Ptef-G418-Ttef的DNA序列连接至pUC57载体上，获得目标DNA序列模板；
(4)使用同源重组-原生质体转化法将目标DNA序列模板导入少孢节丛孢菌中，在含有G418抗生素的培养基上进行筛选；
(5)设计特异性引物进行转化子验证。
2.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(2)中，Ptef-G418-Ttef的DNA序列长度为2170bp。
3.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(3)中，获得的目标DNA序列模板转化保存在E.coli DH5α中。
4.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，使用同源重组-原生质体转化法，所用的同源臂长度为1000-2500bp。
5.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，G418抗生素的培养基中，G418抗生素浓度为175-250μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，原生质体转化法使用的是PEG/CaCl2介导。
7.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(5)中，特异性引物的Tm值为58-62℃。
8.根据权利要求1-7中任意所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(5)中，转化子验证的反应体系为25μL，由5μL的5×Buffer、5μL的浓度为20mmol/L的dNTP、0.75μL的浓度为10μmol/L的上游引物、0.75μL的浓度为10μmol/L的下游引物、0.5μL的KOD FX Neo酶、以待验证菌丝为模板和13μL无菌水组成；PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，Tm温度退火30s，68℃延伸1kb/30s，共35个循环；72℃延伸10min。
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