[发明专利]一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法

说明书

本发明公开了在少孢节丛孢菌中建立了一种新的遗传转化筛选体系，将有利于该真菌遗传转化体系的多层次应用。该方法包括如下步骤：首先将G418编码的对应氨基酸序列根据少孢节丛孢菌密码子偏好性进行密码子优化；将优化后的DNA序列在5’加上Ptef，3’加上Ttef，接着连接在pUC57载体上进行合成，获得Ptef‑G418‑Ttef的DNA模板；在使用时根据实验要求设计特异性引物进行PCR合成使用；使用同源重组‑原生质体转化法将G418导入少孢节丛孢菌。本发明为少孢节丛孢菌增加了一种新的抗性选择标记，可使原来对G418敏感的少孢节丛孢菌对其产生抗性，可对少孢节丛孢菌进行遗传基因操作，为研究少孢节丛孢菌的基因功能带来了巨大方便，而且费用低廉。

技术领域

本发明属于微生物基因工程生物技术领域，具体涉及在丝状真菌少孢节丛孢菌中建立一种G418遗传转化筛选体系的方法。

背景技术

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是一类捕食线虫丝状真菌，属于子囊菌门，在普通环境中营腐生生活，但是当在周围环境中存在线虫时该丝状真菌通过营养菌丝体特化形成三维菌网来捕食线虫。此菌广泛存在土壤环境中，在人体健康、生物医药、农业生产及环境保护等具有独特作用。在基因工程中，丝状真菌筛选方法常用的是潮霉素B抗性基因作为筛选标记，单一的筛选标记限制了丝状真菌基因工程操作研究中多层次的应用。建立新的筛选标记的分子操作技术可满足日益发展的实验研究需求。

G418(Geneticin)是由红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)产生的一种结构与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似的氨基糖苷类抗生素。在分子遗传学中，G418是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。在少孢节丛孢菌遗传转化体系中，最常用的筛选标记基因是潮霉素B抗性基因，通过潮霉素B抗性标记可以筛选获得少孢节丛孢菌突变菌株，进一步进行少孢节丛孢菌基因功能的研究，更好的发挥少孢节丛孢菌在生物防治、环境修复及生态平衡中的作用。但在研究少孢节丛孢菌基因功能时，往往需要对其进行基因敲除实验，在此基础上对敲除突变株进行基因功能互补验证实验。那么，单一抗性筛选标记往往不能满足实验要求，必须要有其他新的抗性选择标记才可以进行遗传转化子的筛选。长期以来，用于少孢节丛孢菌遗传转化的选择性标记仅有潮霉素B，缺乏其他有效的抗性选择标记。因此，扩展少孢节丛孢菌显性筛选标记具有非常重要的意义。

本发明提供的少孢节丛孢菌遗传转化筛选体系在基因遗传上的应用，经文献查阅检索，未见与本发明有相同的公开报道。

发明内容

本发明旨在提供一种以G418为筛选标记的基因遗传操作方法，该应用以G418的抗性为少孢节丛孢菌抗性筛选标记，以解决少孢节丛孢菌遗传转化的选择性标记不足的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)使用少孢节丛孢菌密码子偏好性对G418基因序列进行手动优化，优化后的G418基因序列为SEQ ID No.1；

(2)将上述优化后的G418基因序列5’加上Ptef启动子序列，3’加上Ttef终止子序列，获得Ptef-G418-Ttef的DNA序列；

(3)将上述Ptef-G418-Ttef的DNA序列连接至pUC57载体上，获得目标DNA序列模板；

(4)使用同源重组-原生质体转化法将目标DNA序列模板导入少孢节丛孢菌中，在含有G418抗生素的培养基上进行筛选；

(5)设计特异性引物进行转化子验证。

具体地，上述步骤(2)中，Ptef-G418-Ttef的DNA序列长度为2170bp。

具体地，上述步骤(3)中，获得的目标DNA序列模板转化保存在E.coli DH5α中。