[发明专利]基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法

权利要求书

1.一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌培养，选择丝状真菌培养完整生长周期内的至少两个不同时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入清洗液涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入裂解；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机采集样品图谱；

步骤4、将所有样品的图谱分别进行筛选整合形成该样品的蛋白指纹图谱，并将每个样品整合后的蛋白指纹图谱构建数据库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌通过沙保罗琼脂平板的固体培养方式培养；选择培养12-18h、3d和7d的三个时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入乙醇涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入甲酸裂解；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机检测；

步骤4、仪器参数设置为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，在对仪器校准后，分别采集每个样品的图谱，将图谱导入分析软件进行图谱筛选并合成一张蛋白指纹图谱，将每个样品合成后的蛋白指纹图谱构建数据库。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤2为：

收集0.5-1mg的菌丝体和/或孢子加入0.5-2mL 75％乙醇中，涡旋振荡，离心弃上清，沉淀完全干燥后，向沉淀中加入20-50μL甲酸，吹打或涡旋振荡直至菌体裂解；或采用物理破碎手段破碎沉淀，然后再加入甲酸裂解。

4.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述点样的个数为每个样品2-12个。

5.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述基质溶液为α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。

6.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中图谱采集为每个样品采集6-36张图谱。

7.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中导入分析软件的图谱不少于6张。

8.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述仪器参数为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，质量范围1000-20000，延时时间为0-500，图谱累加次数为100-1000次，峰强度为12000-120000。

9.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中合成一张蛋白指纹图谱的要求为：各张图谱之间的最大差异为按照仪器默认设定值，峰数量30-100，各峰间误差为50-500，图谱间最大误差1500-3000。

10.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述丝状真菌选自烟曲霉、构巢曲霉或黄曲霉。