[发明专利]基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种基于基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法。本发明构建方法对菌株前处理方法进行优化，在确保前处理效果的前提下简化了前处理步骤，降低了前处理成本，降低了操作危险性。同时采用多维建库的方法，采集丝状真菌不同培养阶段的蛋白指纹图谱，优化建库参数，构建数据库，提高数据库库容量的同时，提高丝状真菌质谱鉴定准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法。

背景技术

近年来，随着激素，免疫抑制剂和广谱抗生素在临床上的广泛使用，免疫功能低下人群数量不断增加，由真菌引起的感染越来越多，快速准确鉴定真菌成为病原学诊断的重点工作，目前真菌的鉴定主要还是以形态学鉴定为主，对真菌的准确鉴定与操作者的经验和工作年限密切相关，由于真菌形态特征复杂多变，且易随环境的变化而表现不同的形态特征，加之临床上抗真菌药物的使用使真菌的鉴定更加困难；免疫血清学检验1，3-β-D葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)易受共同抗原影响，特异性低，检测菌种种类有限，且不能确定菌种种类；分子生物学方法虽然检测的准确性高，但操作复杂对人员操作要求高，且有些特殊的丝状真菌仍无法检测和鉴定。快速，准确的真菌鉴定方法成为临床诊断和治疗的关键要素。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，缩写MALDI-TOF MS)技术是近年来迅速发展起来的一种新型软电离质谱技术。得益于质谱技术在微生物鉴定方面的飞速发展，质谱仪在西方国家临床微生物实验室的逐渐普及，近年来国内学者们也越来越重视该技术。相比传统方法而言，MALDI-TOF MS质谱仪具有鉴定速度快、准确和低成本等绝对优势，CinziaBenagl等研究显示MALDI-TOF MS可以实现几分钟内得到鉴定结果且鉴定准确率高达98％以上，明显优于传统的分类学方法。在临床微生物、海关进出口商品的检验检疫、疾控中心的微生物传染病原的鉴定与监测和食品生产中的微生物检测等领域应用广泛。然而在丝状真菌鉴定方面受到诸多因素的影响，鉴定效果有待提升。主要表现在鉴定分值低，准确率低且操作繁琐，没有标准的操作流程。主要原因由于丝状真菌特殊的细胞壁结构而破壁困难，导致蛋白释放率低，表现为蛋白指纹图谱峰数量少，强度低，而影响质谱鉴定效果；数据库的容量低，且不同培养阶段菌种的特征性图谱峰差异较大。为解决丝状真菌破壁的问题，黄艳飞，鲁辛辛等对丝状真菌的前处理方法进行了研究并申请了专利《丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术》，丝状真菌液体培养后，通过洗涤及乙醇灭活，在甲酸乙腈提取法的基础上，加入玻璃珠涡旋震荡并利用超声波进行破壁，使蛋白充分释放出来。操作复杂繁琐，用时较长，单个样品处理需要近50分钟的时间。马庆伟、冯立平等结合研究者们的方法并进行积极的探索设计了操作简单的试剂盒，用于微生物质谱鉴定的样品制备。苍金荣、王翠等利用“双甲酸夹心法”实现对丝状真菌的鉴定，操作更加简单。而最常用的方法是乙腈甲酸提取法(乙醇/甲酸法)，众多文献中使用此方法进行丝状真菌的前处理，同时结合自建库得到较好的鉴定结果；在《中国临床微生物质谱应用专家共识》中微生物专家们系统地总结了微生物质谱鉴定的流程、影响因素等内容，而在丝状真菌的鉴定中专家共识推荐使用液体旋转培养法结合乙醇/甲酸提取法进行。

在数据库构建方面，各厂家及专家学者们都在探索不同的构建方法及参数，主要过程包括菌株的标准化、菌株培养及前处理、蛋白指纹图谱采集、构建数据库。相对于细菌而言，丝状真菌由于其生长周期内的变化较大，不同菌龄差异大，难以实现不同菌龄菌株的准确鉴定，因而制约了丝状真菌质谱鉴定的发展和在临床中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，使得所述构建方法能够以更简化的步骤高效构建丝状真菌指纹图谱，并且丝状真菌的质谱鉴定不受培养基、培养时间，以及孢子和菌丝的影响，在不同培养基和不同培养时间的菌株都能得到准确的鉴定。