[发明专利]一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法及试剂盒

说明书

一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法及试剂盒，包括核酸提取得到待检核酸；以两组RT‑RAA引物同时扩增两个待检测位点并得到核酸产物，分别是Cas12a靶向的N基因扩增产物与Cas13a靶向的S基因扩增产物；配置CRISPR反应混合液，2μL核酸扩增产物加入到CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟，通过读取荧光获得检测结果。本发明具有检测速度快、准确度高、成本较低的优点。本发明克服了DETECTR与SHERLOCK系统的不兼容性，在不降低检测方法灵敏度与精确度的前提下，成功将源自瓦氏细单胞菌的LwaCas13a与源自链霉菌ND2006的LbaCas12a统一起来，实现了利用CRISPR系统对两个靶标位点进行同时检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法及试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(COVID-19)，简称“新冠病毒”，是一种新发现的单链RNA病毒，全长29903个核苷酸，通过飞沫经呼吸道与结膜传播，传染性强，传播范围广，是目前已知的第七种对人类致病的冠状病毒。相比于其它冠状病毒造成的急性症状，新型冠状病毒感染症状从轻微、咳嗽、发烧到危重均有出现，感染症状和常见呼吸系统疾病相似，隐蔽性强，传染性极强。

目前针对新冠病毒尚无有效的治疗药物，新冠疫苗的研发需要较长的周期，研发后的疫苗进行全民接种并形成免疫力也需要巨大的疫苗产能以及极长的接种周期。所以防控新冠病毒的最有效手段依然是早检出早隔离，通过核酸检测发现新冠病毒感染者，并对感染者以及相关密切接触者进行隔离从而阻断病毒传播。新冠病毒的核酸诊断金标准是实时荧光定量PCR法(qPCR)，该方法通过PCR扩增新冠核酸目标片段，在扩增时每产生一个目标片段即切割断裂一个taq-man探针，产生荧光信号。荧光信号的产生与扩增产物相同步。由于PCR扩增时模板呈指数增长，其达到设置阈值时进行的循环数(Ct)与初始模板量的倒数存在对数关系，可据此进行定量分析，从而实现对新冠病毒的定量检测。但是qPCR需要昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，且检测周期一般较长需要3-4小时，难以满足在一些特殊场景的筛查需求，如资源匮乏地区如偏远农村的疫情防控。

现有的一些核酸快速检测方法由RT-LAMP(逆转录-环介导等温扩增)以及RT-RPA-exo探针法(逆转录-重组酶聚合酶扩增exo探针法)，这类方法通过牺牲部分精确度与灵敏度摆脱了对变温设备的依赖，在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，目的核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于RT-LAMP或RT-RAA的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是检测精确度与灵敏度相比于qPCR则有一个巨大的下降。基于CRISPR/Cas系统的恒温检测则在恒温扩增方法的基础上引入了精确灵敏的CRISPR系统，极大提高了检测方法的精确度与灵敏度。