[发明专利]一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。本发明自行设计了裂谷热病毒数字PCR引物和探针，并建立了裂谷热病毒数字PCR检测方法，方法灵敏度为150copies/mL，与血液样本中虫媒病毒无交叉反应，能直接计算临床样本中裂谷热病毒的拷贝数，无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量，建立的方法具有较高准确性、灵敏度、特异性和临床适用性。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

裂谷热(Rift Valley Fever)是由裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus，RVFV)引起、由节肢动物传播的急性传染病，可感染多种脊椎动物。1931年首次在肯尼亚证实了本病的存在，并分离到病毒。人感染裂谷热病毒后临床特点为突然发热(常为双相热)、头痛、肌肉关节疼痛等，重症病例可表现为多脏器受累。本病主要流行于非洲，亚洲中东地区也有报道。我国于2016年7月23日通报了首例输入性裂谷热病例。

RVFV为RNA病毒，属于布尼亚病毒科白蛉病毒属。病毒直径约90～110nm，球形，有包膜。基因组为分节段的单股RNA，分为L、M、S三个片段，长度分别为6.4kb、1.7kb和3.9kb，其中L和M片段为负链RNA，S片段为双义RNA。L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶，M片段可编码至少4种产物：糖蛋白Gn和Gc、NSm和一种NSm与Gn的融合蛋白，S片段编码病毒核蛋白和NSs。目前国内采用实时荧光RT-PCR等核酸扩增方法对裂谷热病例进行核酸检测。

数字PCR技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统实时荧光PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统实时荧光PCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性，数字PCR迅速得到广泛的应用，在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。而且其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、高通量测序文库精确定量和结果验证等诸多方面也具有广阔应用前景，已经受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR引物和探针；

所述数字PCR引物及探针的序列为：

上游引物RVFV-f：5’-GAAAATTCCTGAGACACATGGCAT-3’；

下游引物RVFV-r：5’-TTCCACTTCCTTGCATCATCTGA-3’；

探针RVFV-p：5’-CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATT-3’。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述探针的5’标记FAM，3’标记BHQ1。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括数字PCR预混液、逆转录酶、上下游引物、探针、H₂O和模板。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中各组分的含量为：数字PCR预混液11.5μL、逆转录酶1μL、上下游引物各0.4μL、探针0.4μL、H₂O 4.3μL和模板2μL，终体系20μL。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述上下游引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2μM。

本发明还提供一种利用所述试剂盒检测裂谷热病毒的方法，其具体检测方法包括如下步骤：