[发明专利]基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法

说明书

本发明提供了一种基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法。本发明测试不同破碎管对组织以及病原体的破碎效果，发现Lysing Matrix A管可替代常规的组织研磨加Proteinase K消化过程做到组织匀浆，最终选用Lysing Matrix A管进行组织破碎匀浆后，选用Lysing Matrix E管进行病原体破壁，压缩了组织样本的后续宏基因组快速建库和测序时间，满足了临床对于感染样本检测的需求，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法。

背景技术

感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因，一直备受临床关注。新型冠状病毒肺炎的全世界范围大流行，给世界经济和人类健康带来严峻挑战，让病原的精准快速检测成为关注的热点。多种病原体(细菌、真菌、病毒等)均可以引起感染，病原微生物诊断的准确性、敏感性和诊断速度决定着临床病原诊断效能。传统临床微生物实验室鉴定病原体的主要方法是涂片镜检和培养，结合质谱、免疫和分子等技术，但其存在局限性，每类检测均只针对特定病原体类型，难以同时对常见的细菌、真菌和病毒等病原体做到快速区分；难培养、罕见及新型病原体的检测能力有限，无法精准用药导致抗菌药物耐药问题愈发严重。

宏基因组测序技术可以在一次检测中全面、无偏向性地检出样本中的微生物组成，发现罕见和新型病原体，为临床决策提供更全面精确的参考。但是现有的基于二代测序技术的宏基因组分析耗时长、读长短、拼接错误率高，这限制了其在临床快检中应用的可行性。三代测序技术PacBio在测序读长方面有了很大提高，但其缺点在于建库流程较为复杂，而且同二代测序一样存在测序周期长的缺点，一轮测序结束，需要几十个小时完成数据下机，加上后续分析时间，很难满足病原微生物的快速鉴定。

近年来发展起来的纳米孔测序技术则恰好可以弥补其他测序平台的劣势，其测序片段长度长、测序时间短、数据实时产生、设备小巧便携的特点，具有提高病原微生物检测的准确性、缩短报告周期(TURN-AROUND TIME，TAT)的特点，并适合医院及现场检测，契合临床感染诊断的需求场景，有希望成为下一代的感染诊断技术。

在宏基因组的研究领域，对于组织样本的采集，《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》建议尽可能采集病灶边缘或病变与正常交界处组织，但是实际情况组织获取困难，样本量非常少，且组织样本的宿主核酸量极高，病原体reads被检测到的数量非常少。所以，组织样本是否充分破碎对后续实验的成功与否有着重要影响。

组织处理的常规流程(比如组织基因组DNA提取等一些成熟的商业化试剂盒)用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器)，再加入Proteinase K混匀后，在56℃或者65℃放置，直至组织溶解。不同组织裂解时间不同，通常需65℃孵育2小时左右或者难消化的组织甚至需要56℃过夜孵育。

组织处理的常规流程在实际操作过程中存在以下几点问题：

1.步骤比较复杂。一般常规的组织处理操作流程，在组织中加入PBS，盖紧EP管盖，来回颠倒EP管4～5次，吸弃液体。重复上述步骤两次后，再次加入PBS研磨，然后再加入Proteinase K孵育。2.手动研磨组织困难。一般常规的组织处理需要使用高温灭菌后的无菌研磨杵将组织充分研磨至米糊状，需要花费数小时不等，人工研磨很困难，且也不能满足商业化多样本快速处理要求。3.可能影响建库成功率和病原检出率。如果样本处理过程中手动研磨不均匀，容易导致后续宿主去处不干净，影响组织样本建库成功率以及病原检出率。4.操作时间过长，不能满足感染样本对时效性的需求。手动研磨组织因样本情况不同差异比较大，通常需要数小时不等。此外，常规的组织处理过程在研磨后还需要加入Proteinase K，再置于65℃金属浴震荡孵育2小时或者56℃震荡孵育过夜，消化至无可见块状组织。