[发明专利]介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法

权利要求书

1.一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）SBA-15分子筛的酸化预处理活化以获得更多的羟基，室温下将SBA-15分散到6MHCl中，通过磁力搅拌器搅拌10-12小时，离心，水洗至上清液的pH为中性，室温下真空干燥，之后继续在100-110℃下真空干燥4-6小时；

2）SBA-15介孔分子筛材料的氨基功能化，将活化后SBA-15均匀分散在无水乙醇的溶液中，然后与含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）的无水乙醇溶液均匀混合，混合物在氮气（N₂）下50-60℃搅拌10-12小时，离心，收集氨基功能化的SBA-15（SBA-15-NH₂）并用无水乙醇溶液洗涤，在45-50℃下真空干燥4-5小时；

所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷和SBA-15分子筛分散液体积比例为1:150；SBA-15分子筛分散液的浓度3.31mg/mL；

3）SBA-15介孔分子筛材料的硼酸功能化，将氨基功能化的SBA-15介孔分子筛乙醇分散液中加入2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸和氰基硼氢化钠，室温下反应20-24h，离心，收集获得的硼酸功能化的SBA-15，然后分别用无水乙醇和水洗涤3次；

所述的SBA-15-NH₂、2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸、氰基硼氢化钠和乙醇的质量体积比例为10mg:15-35mg:15-35mg:3mL；

4）介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备，将硼酸功能化的SBA-15加入到含N-乙酰神经氨酸的pH9.0磷酸盐缓冲液中，孵育20-30min，离心收集结合N-乙酰神经氨酸的SBA-15；并重新分散于无水乙醇中，然后加入包含氨水和硅酸四乙酯（TEOS）的无水乙醇溶液中，反应20-30min，反应混合物离心，并收集制备的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器；45-50℃下真空干燥4-6小时；最后，使用模板洗脱溶剂1M的HAc溶液在室温下震荡洗涤产物，直到在电化学检测器上电流值不再改变；

所述的硼酸功能化的SBA-15，磷酸盐缓冲液，模板单糖N-乙酰神经氨酸，氨水，TEOS和乙醇溶液质量体积比例为30mg:1mL:30mg:0.7mL:22.4μL:50mL，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为9.0。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中的反应温度为20-30℃，时间为24小时。

3.一种由权利要求1所述的制备方法所制备的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器。

4.一种权利要求3所述的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的应用，其特征在于应用于N-糖蛋白组学的分析。

5.按照权利要求4所述的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的应用，其特征在于包括以下步骤：

1）将介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器置于离心管中，加入血清样品，再加入pH为8.0的Tris-HCl的缓冲液使材料浸润；通过在室温下震荡使溶液中的蛋白质基于尺寸排阻作用完全吸附在介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的孔径内，通过离心使材料与未吸附的溶液分离；

所述的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的含量与蛋白质含量的比例为1.5-12mg:100-140μg；所述的缓冲液浓度为50mM；

2）向已经吸附有蛋白质的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器中依次加入尿素溶液，其浓度为8M，体积为12μL；加入DTT（DL-1,4-二硫代苏糖醇）溶液，混合均匀后置于水浴锅中，反应温度为50℃，反应时间为20min，DTT的浓度为40mM，体积为3μL；冷却至室温后加入IAA（碘乙酰胺）溶液，其浓度为40mM，体积为3μL，在黑暗处进行反应，反应时间为20min；按照蛋白质/酶的比例为25/1加入胰蛋白酶，在37摄氏度下进行酶解，酶解时间为10-60分钟，使蛋白质酶解为肽段；

3）往酶解后的溶液中加入磷酸缓冲液，其pH为7.4，浓度为50mM，体积为504μL，缓慢震荡，温度为室温，时间为1h；使溶液中的糖肽被选择性吸附在介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的特异性空穴中；

4）使用磷酸缓冲盐的pH为7.4，浓度为50mM，体积为1000μL，对吸附有糖肽的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器进行洗涤，清洗3次；离心将淋洗溶液和SBA-15@MIP分离；

5）用HAc溶液进行糖肽的洗脱，在室温下震荡30min，收集含有糖肽的洗脱液；HAc溶液的浓度为1M，体积为1000μL，洗脱温度为室温，洗脱时间为30min；洗脱溶液将吸附的糖肽洗脱进行质谱分析。