[发明专利]介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法

说明书

本发明涉及一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法。该法以SBA‑15介孔分子筛为载体，2,3‑二氟‑4‑甲酰基苯硼酸为单体，以N‑乙酰神经氨酸为片段模板制备基于分子筛的表面定向印迹聚合物（SBA‑15@MIP）。该微反应器利用尺寸排阻作用提取样品中的蛋白质，基于纳米限域作用快速酶解蛋白质，以分子印迹的特异性识别作用选择性富集含糖链的肽段。本发明方法使用材料廉价易得，易于制备，操作简便，可以集成蛋白质提取，蛋白质快速酶解以及糖肽富集这三个样品预处理过程，可有效缩短糖蛋白组学样品前处理的时间。

技术领域

本发明属于糖蛋白组学分析领域，具体涉及一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法。本发明能完成快速蛋白质提取，酶解和糖肽富集这三个样品预处理过程，与目前常用的N-糖蛋白组学分析方法相比，具有较少的样品损失和更高的分析灵敏度，且能显著地缩短从血清样品中获取糖肽所需的时间，具有快速、简便、样品损失低等特点。

背景技术

糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰（Proteintranslationalmodifications，PTMs）之一，是哺乳动物生存所必需的。据估计，大约50%的人类蛋白质发生糖基化。异常的糖基化现象与人类疾病如炎症疾病密切相关，如类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病以及癌症。因此，糖蛋白可以作为疾病检测的有效生物标志物，也可作为药物和疫苗开发的靶点。然而，由于聚糖的异质性，糖蛋白的低丰度和动态性，基于质谱的鸟枪法分析复杂生物样品中的糖蛋白信息仍具有很大的挑战性。因此，对蛋白样品进行前处理使糖肽达到质谱的检测水平是糖蛋白质组研究首先要解决的一个重要问题。

糖蛋白组学的样品预处理通常包括三个部分：蛋白质提取浓缩，蛋白酶解，糖肽富集。传统的预处理方法通常只针对其中一个步骤或者三部分分开逐步进行，每步之间均需要进行样品转移，并且当两步骤之间的溶剂条件不匹配时还需要对样品进行除盐、冻干等操作，这极易导致样品损失，因此不适合用于微量蛋白样品的处理。

蛋白质微反应器（Proteomicreactor）作为一种有前途的蛋白质分析技术出现，其是将蛋白质提取浓缩，酶解和脱盐等多步骤集成到一个材料上的新型微反应器，无需多步转移，具有快速、简便、样品损失低、灵敏度高、易于自动化的优势。糖蛋白微反应器（Glycoproteomicreactor）是在蛋白质微反应器的基础上发展而来，专门用于处理和鉴定糖蛋白，实现糖蛋白样品前处理的新型材料。然而，由于蛋白酶解基质和糖肽富集基质存在的较大差异，制备同时具有酶解和富集功能的糖蛋白微反应器仍具有一定的难度，导致糖蛋白微反应器的研究较少，发展相对缓慢。目前现存的糖蛋白微反应器多是通过两种或两种以上功能材料的耦合制备，制备过程繁琐；或是将蛋白质脱糖处理后基于非共价作用结合糖链，而无法进行特异性N-糖基化肽的富集（中国专利CN201811243022.5）。

CN107189011A公开了一种中空分子印迹聚合物、固相萃取柱，它是以介孔分子筛MCM-48为基质，以3-氨基苯硼酸为修饰剂，对甲基丙烯酸单体进行化学修饰，使得甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构。该固相萃取柱需要采用氢氟酸腐蚀掉基质介孔分子筛MCM-48，制得中空分子印迹聚合物。该固相萃取柱与高效液相色谱检测方法结合，在药品中检测含有顺式二醇结构的核苷类物质含量的应用。

迄今为止，尚无涉及基于分子印迹技术特异性识别糖肽的糖蛋白微反应器的文献报道，特别是提供一种集成蛋白质提取和酶解并特异性富集N-糖肽功能的糖蛋白微反应器的制备方法，具体为以SBA-15（SBA系列，SantaBarbaraAmorphous）介孔分子筛为载体，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸为单体，以N-乙酰神经氨酸为片段模板制备基于分子筛的表面定向印迹聚合物。该方法将有利于实现复杂生物样品中N-糖肽的快速前处理，高选择性富集和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质组学的研究。

发明内容