[发明专利]一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒

权利要求书

1.一种试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中5-羟色胺和褪黑素的应用，

所述5-羟色胺和褪黑素对应的内标物分别为：5-羟色胺-d4和褪黑素-d4；

所述的试剂盒包含如下试剂：

（1）洗脱液：

洗脱液A：0.1%甲酸-2mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；

（2）校准品溶液：

将包含有5-羟色胺20μg/ml和褪黑素0.02μg/ml的混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述空白血清基质为5%~15%甲醇水溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；

褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml；

混合内标溶液：

包含有5-羟色胺-d4 10000ng/ml和褪黑素-d4 40ng/ml的甲醇水溶液；

萃取液：

甲基叔丁基醚；

pH调节剂：

0.2M碳酸钠溶液；

质控品：

含有5-羟色胺和褪黑素的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC-L、QC-M、QC-H，其中，

QC-L为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至10000倍；

QC-M为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至1000倍；

QC-H为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍；

所述应用它包括如下步骤：采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的5-羟色胺和褪黑素，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述5-羟色胺和褪黑素的含量，具体色谱条件为：

（1）超高效液相色谱条件：

流动相A：0.1%甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Waters BEH C18；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至2:98；在1.5-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.5-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.5分钟；

所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取200 μl血清于1.5 ml离心管中，向其中加入20 μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及 900μl甲基叔丁基醚，振荡3~10 min后，在12000~15000 r/min，4~20℃的条件下离心4~10 min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50%甲醇水溶液混合，振荡1~5 min后，在12000~15000 r/min，4~20℃的条件下离心1~5 min，取上清液待进样；

（2）质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV，ESI+；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/hr；锥孔气流速为150L/hr；同时监测了各目标物及其对应同位素内标；

经过预处理的血清按照如下方法制备：每个浓度点样品取200 μl于1.5 ml离心管中，向其中加入20 μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及 900μl甲基叔丁基醚，振荡5 min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心5 min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl50%甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心3 min，取上清液65μl，进样5μl；

校准品的前处理按照如下方法制备：每个浓度点样品取200 μl于1.5 ml离心管中，向其中加入20 μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及 900μl甲基叔丁基醚，振荡5 min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心5 min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl50%甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心3 min，取上清液65μl，进样5μl；

质控品的前处理按照如下方法制备：分别取质控品溶液QC-L、QC-M、QC-H，200 μl于1.5ml离心管中，向其中加入20 μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及 900μl甲基叔丁基醚，振荡5 min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心5 min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50%甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800 r/min，10℃的条件下离心3 min，取上清液65μl，进样5μl；

其中，所述内标工作液是由混合内标溶液与甲醇混合配制而成，混合内标溶液与甲醇以体积比为1:99。