[发明专利]一种用于检测新冠病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒

说明书

本发明提供一种新冠病毒(SARS‑CoV‑2)的双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其使用方法，所述方法基于抗体实现的，所述抗体对由如下方法筛选获得：免疫原制备，动物免疫，阳性杂交瘤细胞筛选及建株，腹水制备与抗体纯化，纯化得到的22株抗体进行配对优化，最终获得一对可以检测SARS‑CoV‑2的配对抗体：包被抗体64360A#4:27，检测抗体64360A#5:42。本发明的ELISA检测方法，操作简便，敏感度高，可以特异检测新冠病毒的结构蛋白N蛋白，且不与SARS病毒N蛋白产生交叉反应，检测灵敏度达100pg/mL。

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技术领域

本发明涉及新冠病毒的检测及诊断领域。更具体地，本发明涉及一种可以用于新冠病毒检测的双抗体夹心ELISA方法，在新型冠状病毒感染的筛查，检测和预后评价中具有重要应用价值。

背景技术

新冠病毒(SARS-CoV-2)与引起中东呼吸综合征MERS病毒和严重急性呼吸综合征SARS病毒同属于冠状病毒的大家族。SARS-CoV-2有一个大小为30kb的正义、单链RNA基因组。它的核衣壳蛋白(N)是由膜蛋白(M)、包膜蛋白(E) 以及刺突蛋白(S)组成的外膜，包裹着病毒的基因组。N蛋白是由两个结构域组成的磷酸化蛋白，可与病毒RNA结合，参与RNA合成和蛋白翻译，是病毒复制过程表达拷贝最多的结构蛋白，它性质稳定的特点决定了其作为病毒抗原检测的独特优势。

截至目前，国家药品监督管理局共批准新冠病毒检测试剂15个，其中核酸检测试剂10个，抗体检测试剂5个，没有批准病毒抗原的相关检测。核酸检测是病原物检测的金标准，该方法对实验室条件、检测人员、仪器要求较高，且呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点，对感染病例检测的准确度只有30％-50％。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的IgM或IgG抗体，IgM抗体出现较早，IgG抗体出现较晚，该方法可以作为核酸检测的有效补充。对于新冠病毒核酸检测阴性的疑似病例，可以采用抗体检测作为补充检测指标。对于新冠病毒核酸检测的疑似病例，也可以用抗体检测来协同使用。

相较于核酸检测，抗原检测方便、快速和低价等优势，而相较于抗体检测，抗原检测无窗口期，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测。对于这种传染性很强的新冠病毒感染，提高检测便利程度和敏感度格外重要，而抗原检测具有目前抗体检测所不能替代的优势，预期冠状病毒感染和防治的态势将会是长期的，高敏感检测方法需求强烈，高亲和力的配对抗体在抗原检测产品开发中尤为重要。新冠病毒的N蛋白长度为422个氨基酸，由序列比对可知，该蛋白与SARS冠状病毒株号为GD01的N蛋白序列(Genbank ID为AAP51234)一致性达到了90.5％，通常制备的抗体难以将二者进行区分，这增加了抗体制备的难度。双抗体夹心ELISA 方法无论是采用传统的双抗体酶联吸附免疫法、酶促化学免疫发光法或免疫胶体金试纸条法，都需要通过特异的抗体完成检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一对可配对的特异性识别SARS-CoV-2病毒N蛋白而不识别SARS病毒N蛋白的单克隆抗体对。

本发明的另一个目的是提供上述特异性抗体对的制备及筛选方法。

本发明的再一个目的是提供一种检测SARS-Cov-2病毒N蛋白的双抗体夹心 ELISA方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一对单克隆抗体，分别为包被抗体和检测抗体包被抗体组成为包括：

(a)轻链可变区

(i)包含SEQ ID NO：01所示氨基酸序列的CDR-H1区。

(ii)包含SEQ ID NO：02所示氨基酸序列的CDR-H2区。

(iii)包含SEQ ID NO：03所示氨基酸序列的CDR-H3区。

(b)重链可变区