[发明专利]一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。本发明以肝肠胞虫的胞壁蛋白基因为靶基因，设计筛选得到了一对特异性强的RPA引物和探针，在此基础上建立了一种检测EHP的Real‑time RPA方法，该方法的操作简单，检测灵敏度高，其最低可检出10copies/μL的质粒DNA分子，且重复性好，检测结果可靠，适用于凡纳滨对虾养殖中EHP病原的检测和鉴定，也是Real‑time RPA首次应用于EHP定量检测的尝试。

技术领域

本发明属于水产病原检测技术领域。更具体地，涉及一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

自1988年我国从夏威夷群岛引进了凡纳滨对虾，并在1992年人工繁殖成功，2000年开始批量育苗生产以来，随着养殖规模逐年扩大，凡纳滨对虾已经成为我国水产养殖业的支柱性品种。近些年我国已经成为世界凡纳滨对虾的第一养殖大国，我国的对虾养殖产业在世界对虾养殖发展中发挥主导作用。然而，病害限制了对虾养殖产业的发展，病毒、细菌、真菌、立克次氏体、寄生虫等都能导致对虾发病。对虾养殖中病毒性病原主要有白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)、桃拉病病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and HematopoieticNecrosis Virus，IHHNV)以及十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)等。其中以白斑综合症病毒(WSSV)的危害最大，但这些病毒目前基本都已建立了相应的检测方法。

近些年来肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)已经成为对虾中仅次于WSSV的第二大病原，目前对该病原的天然宿主、传播途径和感染方式尚无明确结论，亦无针对性治疗方法。EHP主要破坏对虾肝胰腺上皮细胞，中度感染EHP后会出现生长迟缓或停止，重度感染EHP后会出现生长停止或死亡的现象。一般在养殖30～40d后易出现EHP感染，感染早期往往不会影响对虾死亡和摄食率，但偶尔会伴有白便的现象，在对虾仔虾和成虾期均有感染迹象，并且该病有大规模爆发的趋势。为了监测养殖凡纳滨对虾中EHP的感染情况，及时对潜在风险进行针对性处理，有必要建立一种准确、快速、灵敏、特异的检测方法。

目前，针对水产动物病原检测的方法主要有原位杂交、ELISA、胶体金试纸条、PCR及LAMP等。例如中国专利CN 107326074A公开了一种南美白对虾肝肠胞虫LAMP检测的方法及其专用试剂盒。在实际检测过程中，原位杂交和ELISA的耗时长，灵敏度低；胶体金试纸条虽然检测快，但灵敏度偏低；LAMP则存在假阳性较高的情况；PCR检测方法虽然有较高的特异性和敏感性，但是对于精密仪器—PCR仪的依赖，限制了其广泛使用。

重组酶聚合酶核酸扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)具有操作方便，检测速度快，灵敏度高等优点，但该方法的引物设计难度大，方法构建困难，在水产病原检测上的应用较少。中国专利CN111979342A公开了一种利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及其应用，但其不能对肝肠胞虫进行定量，且对扩增产物进行检测时需要开盖，极易造成污染，从而导致假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。

本发明的第一个目的是提供一种检测肝肠胞虫的RPA引物和探针。

本发明的第二个目的是提供一种检测肝肠胞虫的RPA试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种检测肝肠胞虫的Real-time RPA方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：