[发明专利]基于细菌16S rRNA基因序列的细菌“种”水平检测和分析方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于细菌16S rRNA基因序列在“种”水平上鉴定人体菌群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建基于细菌操作系统发生学单元为注释单位的人体菌群16S rRNA基因参比序列库，所述参比序列库包括已获得“种”水平命名的已知细菌和未获得“种”水平命名的未知细菌，对于细菌操作系统发生学单元已获得命名的细菌采用命名名称注释，对于细菌操作系统发生学单元未获得命名的细菌采用所述细菌操作系统发生学单元作为该细菌的唯一命名；

(2)对待检测标本的16S rRNA基因进行序列测定；

(3)将步骤(2)获得的标本16S rRNA基因序列与步骤(1)构建的人体菌群16S rRNA基因参比序列库进行比对及菌种鉴定，将与参比数据库中特定序列完全一致的序列鉴定为参比序列库中特定序列注释名称。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤(3)所鉴定菌种在待测标本中菌群种类、比例、和/或丰度分析的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中所述已获得命名的细菌的名称注释包括致病菌、条件致病菌或益生菌的注释。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中16S rRNA基因序列为V3-V4区序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人体菌群来源于消化道、皮肤、口腔、鼻咽部、眼部、阴道、泌尿道或耳部的菌群。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(2)序列测定为高通量测序。

7.一种构建权利要求1所述方法步骤(1)所述的基于细菌操作系统发生学单元为单位的人体菌群16S rRNA基因序列参比序列库的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)测序和质控：获得来自人体标本中的细菌16S rRNA基因序列，经过质控删除低质量序列；

(2)划分细菌分类学操作单元：将来自步骤(1)的序列一致性达到98.7％及以上的一组16S rRNA基因序列，命名为一个细菌分类学操作单元；

(3)确定细菌分类学操作单元的代表性序列：把在步骤(2)获得的一个细菌分类学操作单元中出现频率最高的前10条16S rRNA基因序列，选为该细菌分类学操作单元的代表性序列，不足10条序列者全部选为该细菌分类学操作单元的代表性序列；

(4)构建细菌系统发生树：使用步骤(3)获得的每个细菌分类学操作单元代表性序列和已经被命名的细菌参考菌株16S rRNA基因序列进行比对，将比对上的细菌分类学操作单元代表性序列，插入到所有已经被命名的所有细菌参考菌株16S rRNA基因序列数据库中，参数设置为LTP50；将插入的OTU代表性序列和已经被命名的细菌参考菌株的16S rRNA基因序列，使用基于Jukes-Cantor修正的邻接法构建所有细菌系统发生树，保守度设为30％；

(5)发现健康人体菌群中的未知细菌：在构建的所有细菌系统发生树上，查询细菌分类学操作单元的代表性序列和相似度最近的16S rRNA基因序列聚集，在树上形成一个分支，将所述分支确定为一个细菌操作系统发生学单元；如果细菌分类学操作单元的代表性序列与在所有细菌系统发生树上最临近的16S rRNA基因序列的一致性达98.7％或以上，且已经获得命名，使用获得命名的细菌名称注释，该类细菌操作系统发生学单元可确定为已知细菌；如果细菌分类学操作单元代表性序列及其在所有细菌系统发生树上最临近的16SrRNA基因序列的一致性为98.7％以下，但和“属”内其他“种”的代表性序列的一致性达95％或以上，可确定为未知细菌的疑似新种；如果细菌分类学操作单元代表性序列及其在所有细菌系统发生树上最临近的参考菌株的16S rRNA基因序列的一致性为95％以下，且尚未获得命名，可命名为未知细菌的高分阶单元，使用编号的高一级的细菌分类学操作单元和细菌操作系统发生学单元编号命名；

(6)获得基于细菌操作系统发生学单元的16S rRNA基因序列参比序列库:将步骤(5)获得的健康人肠道未知细菌的全长16S rRNA基因序列，和所有已经命名发表的已知细菌的16S rRNA基因序列合并，构建人体菌群16SrRNA基因参考序列库；

(7)对步骤(6)获得的16S rRNA基因序列参比序列库，使用16S rRNA基因V3-V4区的通用序列位点，进行剪切，将V3-V4区序列完全相同的条目，进行合并，删除完全重复的序列，形成人体菌群16S rRNA基因序列参比工作库。