[发明专利]基于细菌16S rRNA基因序列的细菌“种”水平检测和分析方法

说明书

本发明公开一种非诊断目的的基于细菌16S rRNA基因序列在“种”(species)水平上鉴定人体肠道菌群的方法。所述方法包括：(1)构建基于细菌操作系统发生学单元为基础的人肠道菌群16S rRNA基因参比序列库，(2)对待检测标本的16S rRNA基因进行序列测定；(3)将标本16S rRNA基因序列与16S rRNA基因参比序列库进行比对并进行菌种鉴定。本发明的方法可将人肠道菌群检测注释到“种”的水平，并揭示其多样性、构成比、丰度等数据。这些数据可用于分析人的肠道菌群是否失调，可发现是否存在已知病原菌、潜在致病菌等，可分析肠道益生菌的种类和丰度，可分析肠道菌群紊乱与健康状态、疾病等的相关性。

技术领域

本发明公开了一个检测分析人粪便标本的细菌16S rRNA基因V3-V4区序列，可从“种“水平检测和注释肠道菌群组成多样性和构成比分析方法，特别是能够检测在数量和比例上占优势的尚未分离和研究的未知细菌，属于微生物生态学、微生物分类学和微生物组学技术领域。

背景技术

微生物组研究开展以来，很多研究提示人的生长发育、营养代谢、疾病状态、免疫反应等和肠道菌群相关，如结直肠癌、肥胖、糖尿病等。可是，人肠道菌群究竟包含多少个“种”(species)？各个“种”的丰度如何？迄今尚无明确答案。过去研究肠道菌群的多样性，主要靠分离培养技术体系。由于所使用的培养基和培养条件有选择性，如培养温度、氧含量、氨基酸和碳水化合物成分、盐浓度等，人们只能获得能够在这些培养基和培养条件生长起来的细菌。忽略了大量的不能够在这些培养基和培养条件生长起来的，暂时还没有能够分离、培养和鉴定的细菌，产生了很多错误信息。

据估计地球上大约有10¹²种原核生物，其中主要是细菌。细菌分类学层级包括界、门、纲、目、科、属和种。“种”是细菌的最低分类学单位。医学最常涉及的细菌分类学单位是“属”和“种”。一个细菌的“属”，可包括几个(如埃希氏菌属，包括6个“种”)或几百个“种”的细菌(如链球菌属，包括200多个“种”)。同一个属的不同“种”的细菌，生物学和医学意义差别很大，有的是益生菌(如嗜热链球菌[Streptococcus thermophilus])，有的是致病菌(如猪链球菌[Streptococcus suis])。因此，对肠道菌群的分类学多样性和构成比的信息，仅仅局限在“属”的水平，是远远不够的，容易产生误导。只有实现“种”水平的分析，才能较好揭示肠道菌群多样性和构成比变化与健康、疾病等的相关性，才有比较清晰的医学参考价值。

所有细菌都有16S rRNA，它是核糖体小亚基上的一种核糖体RNA，参与蛋白质合成等过程，是细菌演化中的分子钟。16S rRNA在细菌基因组中对应的基因序列，即为细菌16SrRNA基因，长度约为1500碱基，由9个可变区(Variable region,V1-V9)和保守区序列交替组成。16S rRNA基因保守区序高度保守，而可变区序列则因种属而异，且变异程度与细菌的系统发生位置(分类学上的种、属、科等)密切相关。因此，使用16S rRNA基因序列分析，可将所有细菌进行鉴定分类。如使用16S rRNA基因全长序列，在大多数情况下可将待测细菌鉴定到“种”的水平。

使用部分16S rRNA基因序列，如V3-V4区段序列，可将研究较多的、公共数据库中具有16S rRNA基因序列已知细菌分类到“种”；由于缺乏参比序列，只能将大部分未知细菌分类到“属”、“科”等高阶分类学单元。少数情况下，因为一些细菌“种”的全长16S rRNA基因非常相似，仅仅依靠16S rRNA基因，无法准确鉴定到“种”。通常把这几个不能使用全长16SrRNA基因区分的“种”，划为一个群(group)。