[发明专利]一种溶瘤病毒NDV-NRP1及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种溶瘤病毒NDV‑NRP1及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。本发明采用反向遗传技术构建重组病毒NDV‑NRP1‑scFv‑GT，利用hTERT启动子在转录水平上实现rNDV在肿瘤细胞的特异性复制，通过NRP1‑scFv与NRP1结合，抑制肿瘤的侵袭生长，过表达α‑Gal抗原表位，则可以实现诱导人体自身的anti‑Gal对肿瘤细胞特异性打靶，激活补体，实现对肿瘤细胞的杀伤，达到有效的抗肿瘤效果。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种溶瘤病毒NDV-NRP1及其构建方法与应用。

背景技术

溶瘤病毒作为一种新的肿瘤治疗制剂，通过病毒对肿瘤细胞的杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制引发抗肿瘤免疫反应。溶瘤病毒疗法联合免疫激活已成为有吸引力的肿瘤治疗手段，同时也具有原位肿瘤疫苗的作用。而且，溶瘤病毒可以构建成具有肿瘤特异性、可强化免疫激活途径或可与其他肿瘤治疗药物联合使用的制剂。1971年匈牙利医生Csatary发现患有胃癌的农场主在感染新城疫病毒(newcastle diseasevirus，NDV)后而治愈，因此发现了NDV具有治疗肿瘤的作用。NDV基因组全长15186(或15192)个核苷酸，有六种结构基因(3’-NP-P-M-F-HN-L-5’)，其中HN蛋白与肿瘤表面的唾液酸受体结合，介导病毒吸附细胞膜；而F蛋白使病毒与宿主细胞膜融合，介导病毒进入细胞，并且F蛋白与病毒的毒力相关。

近年来溶瘤病毒作为一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，在肿瘤治疗中显示出很好的前景,在临床试验中显示出良好的治疗疗效，使其再次成为一个研究热点。NDV作为溶瘤病毒的典型代表，天然拥有对肿瘤细胞靶向复制能力，能够通过直接溶瘤作用杀死肿瘤细胞；同时可激活机体本身的免疫防御系统，使细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞和辅助性T细胞等增殖，加强机体抗肿瘤免疫反应；也可通过感染肿瘤细胞制成疫苗对患者进行特异性免疫治疗。

随着分子病毒学和分子生物学技术的发展，现代溶瘤病毒治疗开始发展为治疗肿瘤的有效手段。分子病毒学技术使得对病毒基因组的改造和重组成为可能。经典遗传学的方向是从研究生物的表型、性状过渡到生命的遗传物质基因组，由表及里，由外而内，以此研究生命发生、发展、变化的规律。而反向遗传学(Reverse Genetics)则是由里及表，通过生物的基因组观察生物将会表现出的表型，性状。反向遗传学是在已知生物体全部基因组序列的基础上，对靶基因进行定向加工和修饰，再按组成顺序构建含物种必需元件的修饰基因组，进而装配出具有生命活性的个体。运用反向遗传学技术可以在体外对RNA病毒基因组进行改造，构建新的负链RNA病毒。反向遗传技术的发展和完善，解决了对病毒进行定向改造及利用其表达外源肿瘤治疗基因的技术难题，同时又可以发挥新城疫病毒本身的天然溶瘤作用，使新城疫病毒载体在临床治疗和疫苗研发上具有很好的应用前景。

有目的性的改造溶瘤病毒，使病毒具有更强的溶瘤能力，单独治疗或与其它抗肿瘤疗法联合使用已经成为溶瘤病毒治疗肿瘤的热门研究方向。随着基因工程技术、分子生物学的不断发展，溶瘤病毒在治疗肿瘤领域中不断取得不菲的成果。首次获得美国食品药监局临床批文的溶瘤病毒是由Amgen公司推出的Talimogene Laherparepvec(T-VEC)，用于黑色素瘤患者在第一次手术后复发的难以切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。T-VEC是经过基因修饰改造的1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1,HSV-1)，具有在肿瘤细胞内复制并表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage-ColonyStimulating Factor，GM-CSF)的特点。将修饰后的1型单纯疱疹病毒直接注射到肿瘤局部，病毒在肿瘤中大量复制，进而导致肿瘤细胞裂解死亡，释放出大量的肿瘤相关抗原(TAA)和GM-CSF因子，增强抗肿瘤的免疫应答。目前，全球范围内注册开展进行中的溶瘤病毒临床试验不少于52项。而在这些溶瘤病毒的临床研究中，尚未发现有一例因溶瘤病毒引起的机体的严重不良反应。