[发明专利]一种基于探针溶解曲线法的烟曲霉唑类耐药分子检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于探针溶解曲线法的烟曲霉唑类耐药分子检测试剂盒。所述试剂盒中包括检测烟曲霉唑类耐药相关基因突变位点的引物探针组合，所述引物探针组合包括用于扩增突变位点TR34和/或TR46的第一引物对、用于扩增突变位点L98H和/或Y121F的第二引物对、用于扩增突变位点T289A的第三引物对和Taqman检测探针。所述检测试剂盒采用多重不对称PCR同时扩增烟曲霉唑类耐药突变的不同靶基因序列，再通过Taqman检测探针溶解曲线分析鉴定，实现对于烟曲霉CYP51A基因的5个常见耐药靶点的多重检测。

技术领域

本发明属于真菌的分子生物学检测领域，具体涉及一种基于探针溶解曲线法的烟曲霉唑类耐药分子检测试剂盒。

背景技术

烟曲霉(Aspergillus.fumigatus)是一种常见的致病菌种，常引起人体过敏反应、慢性和侵入性支气管肺病等严重疾病。烟曲霉既可侵犯免疫功能低下人群，也能在正常人群中致病，其发病率和死亡率均较高。随着医疗技术的快速发展，曲霉菌的诊治水平有了很大的提高。但是，近年来临床上难治性曲霉感染病例有增加趋势，很大一部分原因是由于烟曲霉耐药菌株的增多。烟曲霉CYP51A基因编码产物是唑类药物作用的靶标，特定点突变能导致唑类药物与CYP51A蛋白的亲和力下降，是发生唑类耐药的重要原因。

以培养为基础的微量肉汤稀释法、纸片扩散法等是检测烟曲霉唑类耐药的传统方法。传统方法的检测结果可靠，无需特殊仪器，但最大弱点是费时，传统培养时间为2～3周，药敏试验需要至少3天后观察结果。所以，目前并不能在患者治疗的初期及时提供精确的用药指导信息，耽误病人的治疗。

CN109880892A公开了一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法。该检测方法采集临床标本，用真菌微量DNA提取试剂盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特异引文进行扩增，将扩增结果进行测序，blast确定标本中真菌种类，如果有烟曲霉，优化TaqMan探针，使用realtime PCR技术检测L98H突变型对应的核酸位点DNA第363-365bp有无突变。该发明烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，具有耗时短、敏感性好、准确性高等优势。然而，该方法对检测人员的要求较高，检测人员需要完成提取样本、扩增等步骤，且一次只能检测一种突变菌株，检测效率较低。

因此，提供一种能够准确、同时检测多种突变型耐药菌株的方法，对于烟曲霉感染的治疗具有重要的作用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于探针溶解曲线法的烟曲霉唑类耐药分子检测试剂盒。所述烟曲霉唑类耐药分子检测试剂盒采用多重不对称PCR同时扩增烟曲霉唑类耐药突变的不同靶基因序列，再通过特殊设计的Taqman探针溶解曲线分析鉴定，实现对于CYP51A基因的5个常见的烟曲霉唑类耐药靶点的多重检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测烟曲霉唑类耐药相关基因突变位点的引物探针组合，所述引物探针组合包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和检测探针。

其中，第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于扩增突变位点TR34和/或TR46；

第二引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，用于扩增突变位点L98H和/或Y121F；

第三引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用于扩增突变位点T289A。

本发明提供的引物探针组合，用于对烟曲霉CYP51A基因的5个常见耐药靶点(TR34、TR46、L98H、Y121F和T289A)的多重检测，结合特殊设计的Taqman探针检测烟曲霉的突变位点；其中，TR34和TR46靶点的两条探针可共用一对引物序列；L98H和Y121F靶点的两条探针可共用一对引物序列。