[发明专利]产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法

权利要求书

1.一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法的建立：

(1)以包被液稀释包被抗原至10μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为可溶性重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白；

(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；

(3)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入待检血清样品，阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1K19，阴性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温1小时；

(4)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，阳性对照孔和阴性对照孔加入HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，待测血清样品孔加入相应的HRP标记二抗，100μL/孔，室温1小时；

(5)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入底物显色液100μL/孔，室温下避光10分钟，加入终止液H₂SO₄溶液终止反应，测定OD450nm数值检测吸光度值；

步骤二、结果判定标准的确定：

当样品OD450nm值X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。

2.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中包被液为0.85M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，所述0.85M碳酸盐缓冲液的包被液制备方法为：称取NaHCO₃ 2.93g以及Na₂CO₃ 1.59g，加蒸馏水定容至1L；所述PBST溶液为1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得；所述步骤(2)中封闭液为5％脱脂奶粉，所述5％脱脂奶粉的制备方法为称取脱脂奶粉5g,，加PBS溶液定容至100mL；所述步骤(3)中阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1K19，以PBS稀释2⁸倍(0.25μg/μL)；所述步骤(4)中HRP-山羊抗小鼠IgG二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG稀释2000倍，所述HRP标记相应二抗为HRP标记的山羊抗待检动物IgG二抗稀释2000倍；所述步骤(5)中底物显色液为5％邻苯二胺溶液，所述5％邻苯二胺溶液的制备方法包括称取OPD(邻苯二胺)5mg，量取10mL底物缓冲液进行溶解，加入3％H₂O₂0.15mL，现配现用，其中，所述底物缓冲液为柠檬酸缓冲液，pH值为5.0，所述柠檬酸缓冲液的制备方法包括称取柠檬酸1.92g，Na₂HPO₄称取2.84g，并加蒸馏水定容至100mL；所述步骤(5)中终止液为2mol/L的H₂SO₄，所述终止液的制备方法包括量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓度为98％的浓硫酸21.7mL。

3.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：

所述可溶性重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白的包被抗原表达菌株的构建方法为：根据文献报道的产气荚膜梭菌β1毒素基因序列，设计引物：

Forward(5`-3`)CGGAATTCCATATGGATATAGGCAAAACTACTACTAT

Reverse(5`-3`)GAATGCGGCCGCAATAGCTGTTACTTTATG

从产气荚膜梭菌C型标准株中扩增cpb1基因，构建至pTIG-Trx载体，转化至BL21(DE3)菌株中，标记为BL21(DE3)pTIG-cpb1。