[发明专利]产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法

说明书

本发明公开了一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法，包括步骤一、产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法的建立，步骤二、结果判定标准的确定。本发明属于病原微生物检测技术领域，具体是提供了一种特异性好、灵敏度高、重复性好的检测产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA体系，为动物的产气荚膜梭菌感染情况提供了有效的检测手段，在临床血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价方面具有广泛应用前景，可快速检测的产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体是指一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法。

背景技术

产气荚膜梭菌(C.perfringens)又称魏氏梭菌(C.welchii)，是一种正常情况下人和动物胃肠道中寄生的条件致病菌。产气荚膜梭菌根据其分泌的四种主要外毒素(α、β、ε、ι)分为A、B、C、D、E五个亚型。

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是重要的人畜共患致病菌，可引起人和多种动物的肠毒血症、气性坏疽、坏死性肠炎甚至死亡，该病发病凶险，感染病畜在短时期内迅速发病，若不能及时诊断和治疗，常常会引起休克乃至死亡，患病的幼畜即使存活，也往往由于生长状况不佳被淘汰，严重影响牛羊养殖业健康发展。β1毒素由B型和C型产气荚膜梭菌产生，可导致人和动物致死性的出血性黏膜溃疡和小肠黏膜坏疽甚至是肠毒血症，B型和C型产气荚膜梭菌是家畜中常见的致病株型。该毒素是经典的β型成孔蛋白，可破坏细胞内外的离子平衡，并诱导机体产生IL-1β等炎性因子。

目前，对该毒素的检测尚缺乏相关的检测产品，临床上亟需一种操作方便，敏感性高，特异性好，稳定可靠的方法进行养殖场动物中产气荚膜梭菌的流行病学调查和抗体水平的检测，因此，建立一种针对产气荚膜梭β1毒素单克隆抗体的间接ELISA检测方法非常有必要。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种动物血清中产气荚膜梭菌β1毒素抗体的水平的检测方法和材料，适用于产气荚膜梭菌β1 毒素所引起的临床血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价，具体是一种特异性强、灵敏度高、稳定性良好、可快速检测产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接 ELISA检测方法。

本发明采取的技术方案如下：本发明一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接 ELISA检测方法，包括以下步骤：

步骤一、产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法的建立：

(1)以包被液稀释包被抗原至10μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为可溶性重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白；

该步骤中所使用的抗原为重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白，其制备方法包括以下步骤：

S1：取重组表达菌株BL21(DE3)pTIG-cpb1甘油冻存菌株，在含100μg/ mL氨苄青霉素的LB固体平板上划线，次日挑取单菌落接入10mL含100μg/ mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至菌液OD₆₀₀达1.0以上；

S2：再以1％的接种量接种于200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养3小时，之后加入0.5mM IPTG在20℃条件下诱导表达16 h，离心收获菌体；

(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；

所述PBST溶液为1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得；

所述步骤(2)中封闭液为5％脱脂奶粉，所述5％脱脂奶粉的制备方法为称取脱脂奶粉5g,，加PBS溶液定容至100mL；