[发明专利]一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID No .2所示的天冬酰胺酶；所述重组里氏木霉中，将里氏木霉中原始的纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3的基因替换为所述天冬酰胺酶的基因，并敲除里氏木霉中的原始的纤维素酶EGL1、BGL1，木聚糖酶XYN1和蛋白酶PEP1的基因。

2.一组用于构建权利要求1所述的重组里氏木霉的质粒，其特征在于，包括重组表达质粒和敲除质粒，所述重组表达质粒依次包含所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子序列、编码所述天冬酰胺酶的基因序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的终止子序列；所述敲除质粒依次包含所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的上游同源臂序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的下游同源臂序列。

3.一种权利要求1所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1 .构建如权利要求2中所述的重组表达质粒；

S2 .将所述重组表达质粒转化至里氏木霉中；

S3 .构建如权利要求2中所述的敲除质粒；

S4 .将所述敲除质粒转化至所述里氏木霉中，筛选得到所述的重组里氏木霉。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S4中，先筛选出同时含有所述重组表达质粒和敲除质粒的里氏木霉，再筛选出基因组中成功发生同源重组的转化子，再通过标记回收技术，筛选得到无抗性标记的转化子。

5.一种权利要求1所述的重组里氏木霉或权利要求2所述的质粒在天冬酰胺酶生产中的应用。

6.一种天冬酰胺酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1 .利用权利要求1所述的重组里氏木霉或权利要求2所述的质粒生产天冬酰胺酶；

S2 .从S1的体系中分离得到天冬酰胺酶。

7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，在步骤S1中，生产天冬酰胺酶的方法包括：将所述重组里氏木霉接种于发酵培养基中，接种量1％～20％，20～37℃，培养2～12天。