[发明专利]一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用，属于生物技术领域，该重组里氏木霉利用同源重组技术将里氏木霉菌株大量分泌表达的蛋白质编码序列替换成天冬酰胺酶蛋白质编码序列，提高天冬酰胺酶的表达量和产品纯度，敲除里氏木霉自身的(半)纤维素酶可提高天冬酰胺酶的产品纯度，敲除里氏木霉自身的蛋白酶可提高天冬酰胺酶的产品稳定性。该重组里氏木霉在天冬酰胺酶表达过程中，通过合适的信号肽的引导作用将天冬酰胺酶蛋白质分泌到胞外，所产的天冬酰胺酶产量高、纯度高、稳定性高，胞外蛋白酶活力低，能有效生产来源于里氏木霉及其他微生物的天冬酰胺酶基因，所生产的天冬酰胺酶，可以应用于食品相关行业。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei或Hypocrea jecorina)是一种嗜温腐生性的丝状真菌。最初所分离到的菌株经鉴定为里氏木霉QM6a。从原始菌株QM6a出发，又经过一系列诱变育种，筛选出了一些纤维素酶高产菌株，如Rut-C30。

里氏木霉被广泛应用是因为具有自然分泌大量的内源蛋白质到胞外的能力，而内源性纤维素酶经发酵其产量高达100g/L。里氏木霉因多样的翻译后修饰也让其成为表达同源和异源蛋白质的常用宿主。里氏木霉产出的纤维素酶和半纤维素酶广泛被应用于各行业，如cbh1，cbh2，egl1，egl2，xyn1，xyn2和xyn3等。纤维素酶和半纤维素酶的启动子，具有诱导型和高表达量的特征，部分启动子，如cbh1和cbh2启动子，已被成功用于表达异源蛋白质。但是，里氏木霉在表达异源蛋白质的过程中，内源蛋白质同时也在表达，并且内源蛋白质的表达量远远大过异源蛋白质。因此，里氏木霉粗酶液中除了异源蛋白质还混有大量的内源蛋白质；应用这些粗酶进行食品加工时，混在里面的大量的里氏木霉内源蛋白质会严重影响食品的品质。这些限制了里氏木霉中异源蛋白质表达在食品行业的应用。因此需要基因工程改造，提高异源蛋白质在粗酶液中的纯度。

发明内容

为解决目前里氏木霉中表达异源蛋白质纯度低的问题，本发明的目的是提供一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用，该重组里氏木霉可用于高纯度天冬酰胺酶的生产，所生产的天冬酰胺酶可直接应用于食品加工过程中减少丙烯酰胺的生成。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉，所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID No.1～4任一所示的天冬酰胺酶；所述重组里氏木霉为将里氏木霉中原始的纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3的基因替换为所述天冬酰胺酶的基因，并敲除里氏木霉中的所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶的基因。

所述的天冬酰胺酶是指来源于真核生物的天冬酰胺酶，包括丝状真菌的天冬酰胺酶，更优的是极端嗜热菌Thermococcus kodakarensis、黑曲霉和米曲霉来源的天冬酰胺酶。

所述的重组里氏木霉出发菌株是里氏木霉种，较优的是Trichoderma reeseiQM6a、QM 9123、QM9414、QM 9136、NG14、NRRL 3653、NRRL 3652、NRRL 11236、Sa28、DB746、ME-446、4065MG4或4065MG5，更优的是Trichoderma reesei Rut-C30、RL-P37或PC-3-7。

本发明还提供一组用于构建上述的重组里氏木霉的质粒，包括重组表达质粒和敲除质粒，所述重组表达质粒依次包含所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子序列、所述天冬酰胺酶编码的基因序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的终止子序列；所述敲除质粒依次包含所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的上游同源臂序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的下游同源臂序列。