[发明专利]一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：在大肠杆菌JM109(DE3)中成功构建了SecY非特异性运糖通道，保证木糖在浓度差的作用下，自由扩散进入细胞，并且构建了木糖到木糖醇的代谢途径，实现大肠杆菌利用混合碳源高效发酵生产木糖醇；

包括以下步骤：

（1）在JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌中过表达基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG，构建并表达SecY非特异性运糖通道；所述基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

（2）在含SecY非特异性运糖通道的大肠杆菌中过表达cbXR基因，构建并表达木糖醇的合成途径；所述cbXR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（3）以不同配比的葡萄糖和木糖为主要条件，发酵培养，阐明碳代谢流量智能调控系统的作用。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（1）中所述JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌，其构建方法包括以下步骤：分别设计含有xylF基因、xylE基因同源臂序列的PCR引物以pkD13质粒为模板进行PCR扩增，得到一段两端含有同源臂和FRT识别位点的KANA片段，后转染入含有pKD46质粒、且经过L-阿拉伯糖诱导的JM109(DE3)感受态细胞中；利用基因组序列设计PCR引物验证KANA片段成功替换掉xylF基因和xylE基因，后转染pCP20质粒，用于特异性识别FRT位点，消除KANA基因，获得JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（1）中构建并表达SecY非特异性运糖通道，具体过程包括：用带有相对应酶切位点的四组引物分别对secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因进行PCR扩增，得到四个基因的片段后，将secY(ΔP )和secE基因与pETDuet质粒连接，secG和sCVE基因与prsfDuet质粒连接，获得重组载体pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE；将重组载体pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE转染进入JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌细胞实现SecY非特异性运糖通道在大肠杆菌基因工程菌中的表达。