[发明专利]一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，旨在利用细胞工厂制备木糖醇过程中实现木糖醇的高效合成。本发明通过引入SecY非特异性运糖通道并同时过表达异源的木糖还原酶（CbXR），成功构建一株SecY工程化大肠杆菌。该菌株能通过自我调节，克服CCR效应，缓解5‑磷酸木糖醇对自身转运木糖的抑制效果。凭借外部碳源的变化作为响应信号，将CCR效应及5‑磷酸木糖醇的抑制作用转化为碳代谢网络中的两个重要调节开关，调控细胞对葡萄糖和木糖的代谢能力。这一方法能完全代谢底物中任意比例的葡萄糖和木糖，保证能量向目标产品的最大转化效率，更符合绿色生物制造的要求。

技术领域

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法。

背景技术

生物炼制对保护环境和保护不可再生的化石燃料是有益的，工业生物技术可以将农业废料中的碳源转化为有价值的化学物质，材料和生物燃料，以实现可持续的经济发展。木糖醇是一种五碳糖醇，与蔗糖一样甜，并且天然存在于水果、蔬菜和蘑菇中。由于木糖醇具有低热量，保护牙齿，抗糖尿病和抗致癌等特性，因此被认为是食品、制药和化学工业中有价值的衍生物。木糖醇的化学生产主要以木聚糖为原料人工制造。 相反，通过微生物发酵生产木糖醇更环保，成本更低。

然而，依靠代谢工程技术，利用大肠杆菌在葡萄糖和木糖的混合碳源中生产木糖醇时无法避免两个重要影响因素。首先，葡萄糖存在产生的碳分解代谢阻遏效应（简称CCR效应）抑制木糖转运蛋白表达，导致木糖无法顺利被转运至胞内；其次木糖醇还会被木酮糖激酶磷酸化从而产生5-磷酸木糖醇，对木糖转运蛋白产生反馈抑制。这也是导致木糖醇产量偏低的原因。

虽然目前已有方法在大肠杆菌基因工程菌株中分别克服CCR效应和5-磷酸木糖醇抑制作用，实现木糖醇的转化，但都需要为大肠杆菌额外添加足够的葡萄糖，保证细胞对还原力的持续需求。然而，原始生物质经过预处理后的再利用，其中的碳源配比是随机的，如何理性设计大肠杆菌的碳代谢途径，使能量最大化向木糖醇转化是一个需要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法。通过构建大肠杆菌基因工程菌株SecY工程化大肠杆菌，克服大肠杆菌发酵生产木糖醇过程中的CCR效应和5-磷酸木糖醇的抑制作用，理性设计碳代谢流量的分配，提高微生物发酵法生产木糖醇的产量。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

在大肠杆菌JM109(DE3)中成功构建了SecY非特异性运糖通道，保证木糖在浓度差的作用下，自由扩散进入细胞，并且构建了木糖到木糖醇的代谢途径，实现大肠杆菌利用混合碳源高效发酵生产木糖醇。

过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因于敲除xylF基因和xylE基因的大肠杆菌JM109(DE3)（即JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌），成功构建了SecY非特异性运糖通道。在此基础上过表达cbXR基因，成功构建了SecY工程化大肠杆菌，在大肠杆菌中实现了木糖还原为木糖醇的代谢途径，同时有效缓解了5-磷酸木糖醇对细胞代谢木糖的抑制。利用不同比例的葡萄糖和木糖发酵，阐明了SecY工程化大肠杆菌在碳代谢流量智能调控中的能量代谢方式。

一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，包括以下步骤：

（1）在JM109(DE3)ΔXylFGH-ΔXylE大肠杆菌中过表达基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG，构建并表达SecY非特异性运糖通道；