[发明专利]一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测紫杉醇代谢标志物CYP1B1 432C/G、ABCB1C3435T两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP1B1 432C/G扩增引物、CYP1B1 432C/G测序引物、ABCB1C3435T扩增引物、ABCB1C3435T测序引物和阳性对照。本发明采用以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对紫杉醇疗效与不良反应预测相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测CYP1B1(432C/G)、ABCB1(C3435T)基因多态性紫杉醇，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

技术领域

本发明涉及一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

紫杉醇，一种天然抗癌药物，紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。微管是真核细胞的一种组成成分，它是由两条类似的多肽(a和p)亚单位构成的微管二聚体形成的。在正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡。紫杉醇可使二者之间失去这种动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合，防止解聚，稳定微管。紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生，防止正常的有丝分裂纺锤体的形成，导致染色体的断裂，并抑制细胞的复制，从而发挥抗肿瘤作用。以紫杉醇类药物为基础的治疗方案被广泛应用。临床上发现,即使患者接受相同剂量的同种药物,治疗效果和不良反应也会存在明显差异。这种个体间的差异除了与非遗传因素如年龄、器官功能、药物的相互作用等有关外，还与编码药物的代谢酶和药物转运蛋白基因的多态性有关。

细胞色素P4501B1是细胞色素P450超级因家族成员，其基因转录水平的调控表达主要是经多环芳烃(PAH)诱导激活相关受体，通过芳香烃受体(AhR)复合物发挥作用，CYP1B1与体内甾体类激素的代谢密切相关，可催化17β-雌二醇在位点的羟化作用，导致乳腺癌及其他多种肿瘤的产生。研究表明,CYP1B1 432G基因型mRNA 的表达水平显著增高，CYP1B1的存在可使细胞对多西紫杉醇细胞毒性的敏感性显著降低，增加肿瘤细胞的抗药性。

多药耐药相关基因ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1) 属于ABC转运蛋白家族中最重要的转运蛋白成员,主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物包括化学物质和药物等主动泵出细胞外。ABCB1基因编码的 P-糖蛋白是紫杉醇类药物体内转运途径的关键酶。大量研究表明ABCB1基因单核苷酸多态性可能会改变P-糖蛋白的结构,从而影响其功能活性，继而对紫杉醇类药物清除和细胞内外转运过程产生影响,产生个体化差异的化疗反应。ABCBI C3435T基因位点突变会使细胞的外泵功能下降，周围神经毒性增加(紫杉类化疗药物最主要的不良反应之一)这不仅与紫杉醇类诱导的不良反应相关,并且能够影响患者的远期生存。因此，ABCB1基因多态性具有预测紫杉醇类药物化疗效果和不良反应的潜在价值,对于个体化的药物应用具有重要意义。

目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用 ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以多重RPA扩增和焦磷酸测序技术为基础，获得一种紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的紫杉醇代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：