[发明专利]基于p53靶点的三甲氧基二羟基菲类化合物在抗宫颈癌症方面的应用及检测方法

权利要求书

1.一种基于p53靶点的三甲氧基二羟基菲类化合物在抗宫颈癌症方面的应用，其特征在于，所述的三甲氧基二羟基菲类化合物为1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。

2.一种基于p53靶点的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对宫颈癌Hela细胞作用的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以下检测不分先后顺序；

1、采用IncuCyte活细胞成像系统，检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对Hela细胞增殖的影响；

2、进行细胞划痕实验，量化细胞集体扩散的潜力；

3、进行Hoechst33258荧光染色实验，分析细胞凋亡引起的形态学改变；

4、进行AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡实验，区分凋亡早晚期、坏死及正常的细胞；

5、进行PI单染检测细胞凋亡实验；

6、进行PI单染检测细胞周期实验；

7、进行蛋白质印迹实验，通过凝胶电泳抗原抗体结合的原理，对目的蛋白进行检测；

8、进行siRNA细胞转染实验，小干扰RNA通过与目标基因或是目标基因的mRNA结合,特异性降解靶mRNA，从而沉默目的基因。

3.根据权利要求2所述的一种基于p53靶点的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对宫颈癌Hela细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤1采用IncuCyte活细胞成像系统，检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对Hela细胞增殖的影响；具体包括：

按照0.5×10⁴个/ml的密度取Hela细胞，铺板于96孔板中，分为对照组和药物浓度组，药物浓度组加入不同浓度的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲，将96孔板放置于IncuCyte活细胞成像系统内，定时采集细胞图像动态，计算不同处理条件下细胞融合率；所述1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度为3.125μM-100μM。

4.根据权利要求2所述的一种基于p53靶点的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对宫颈癌Hela细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤2进行细胞划痕实验，具体包括：

按照2×10⁵个/ml的密度取Hela细胞，铺板于96孔板中，进行细胞培养，待细胞融合率达到90％-100％，进行划痕，缓冲液洗，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，在IncuCyte活细胞成像系统中在0h-24h不同时间点进行拍照，计算0h和24h划痕宽度，计算两者的差值，用差值与起始的划痕宽度之间的比值表示细胞的迁移率。

5.根据权利要求2所述的一种基于p53靶点的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对宫颈癌Hela细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤3进行Hoechst33258荧光染色实验，具体包括：

(1)细胞培养：按照7.5×10⁴个/ml的细胞密度取Hela细胞，铺板于六孔板中，进行培养；

(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，所述的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度分别为3.125μM、6.25μM；

(3)固定：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲干预Hela细胞48h小时后，加入4％的多聚甲醛，常温避光固定；

(4)染色：吸出固定液，缓冲液清洗，加入Hoechst 33258染色液染色，37℃避光孵育；

(5)荧光显微镜观察：缓冲液清洗，荧光显微镜下观察细胞形态，拍照。