[发明专利]对非人动物基因改造的方法及构建的免疫缺陷动物模型

权利要求书

1.一种对非人动物，进行基因改造的方法，其包括：

对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，

基因改造包括利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑；

优选地，所述受精卵是体外受精的受精卵；

进一步优选地，所述受精卵是通过体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的；

优选地，利用CRISPR/Cas9方法，需要注射用于同源重组的线性DNA模板大于等于2.5kb，对非人动物的受精卵进行基因编辑是对非人动物细胞的受精卵的细胞核进行显微注射；

优选地，所述非人动物是以NOD为遗传背景的小鼠，

所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(Rag1)或敲除了重组激活基因2(Rag2)或SCID突变的、缺失了T细胞和B细胞的免疫缺陷NOD小鼠，

所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了IL2受体γ链的缺失了NK细胞的重度免疫缺陷NOD小鼠。

3.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：

通过对非人动物的受精卵进行基因改造使得细胞因子基因或免疫相关基因在原位进行人源化，而在这些细胞因子基因或免疫相关基因人源化后免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率不会受到影响；

所述细胞因子包括以下任意一种或两种以上：白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-6(IL-6)、B细胞活化因子(BAFF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)重组蛋白；

所述免疫相关基因包括主要组织相容性复合体(MHC)；

优选地，所述细胞因子为白细胞介素-15(IL-15)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，

对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造，

优选利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑，

进一步优选，对受精卵的细胞核进行显微注射从而利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化；

优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造是在所述非人动物的IL-15第四个外显子的后面插入兼并的人IL-15第五到第八个外显子的编码序列；

优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造还包括在所述非人动物的IL-15第四个外显子后面进一步插入bGHpolyA(bovine growth hormone polyadenylation)序列；

优选地，所述bGHpolyA序列如SEQ ID No.2所示；

优选地，在所述非人动物的IL-15第四个外显子后面插入兼并的人IL15第五到第八个外显子的编码序列如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述非人动物是以NOD为遗传背景的小鼠，

所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(Rag1)或敲除了重组激活基因2(Rag2)或SCID突变的、缺失了T细胞和B细胞的免疫缺陷NOD小鼠，

所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了IL2受体γ链的缺失了NK细胞的重度免疫缺陷NOD小鼠；

优选地，所述小鼠的IL-15第四个外显子的序列如SEQ ID No.4所示。