[发明专利]对非人动物基因改造的方法及构建的免疫缺陷动物模型

说明书

本申请涉及对非人动物进行基因改造的方法及利用该方法构建若干免疫缺陷动物模型，具体来说本申请涉及一种对非人动物，进行基因改造的方法，其包括：对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，基因改造包括利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑。

技术领域

本申请涉及一种对非人动物进行基因改造的方法及利用该方法构建若干免疫缺陷动物模型。

背景技术

小鼠免疫系统人源化通常是指在免疫缺陷型小鼠体内植入人外周血白细胞(hPBMC)或人造血干细胞(CD34+HSC)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞。一方面，小鼠免疫系统人源化过程可以用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能，另一方面人源化的小鼠还能够更好地模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在传染性疾病、抗体药物开发，自身免疫病以及肿瘤学研究等多领域的有不可替代的作用。

免疫系统人源化通常需要使用重度免疫缺陷小鼠。在重度免疫缺陷小鼠表达某些人源化的细胞因子，有助于在小鼠重建完善的人免疫系统。重度免疫缺陷小鼠通常是指NODscid IL2RγKO小鼠(SCID突变及IL2Rγ敲除的NOD小鼠)，BALB/c Rag1KO.IL2RγKO(IL2Rγ及Rag1敲除的BALB/c小鼠)或BALB/c Rag2KO.IL2RγKO小鼠(IL2Rγ及Rag2敲除的BALB/c小鼠。相较于仅有SCID、Rag1或Rag2敲除的普通的免疫缺陷小鼠，重度免疫缺陷小鼠进一步敲除了IL2Rγ，不仅缺少T细胞，B细胞，而且缺少NK细胞功能，并且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少，进一步降低了免疫功能的小鼠，更加有利于人源化免疫系统的构建。

二十年前，日本的实验动物中央研究所(CLEA)发展了以NOD为遗传背景的重度免疫缺陷型小鼠(NOD scid IL2RγKO，)。随后，美国的Jackson Lab也开发了类似的小鼠，命名为很多中国公司也开发了以NOD为背景的重度免疫缺陷型小鼠，分别命名为NPG，NCG，NSI，B-NDG，M-NSG等。除了以NOD为遗传背景的重度免疫缺陷小鼠，还有以BALB/c为遗传背景的BALB/c Rag1/2KO IL2RγKO小鼠。目前，广泛用于重建人免疫系统的重度免疫缺陷小鼠是NOD scid IL2RγKO小鼠，而BALB/c Rag1/2KO IL2RγKO小鼠天然免疫活性比NOD scid IL2RγKO小鼠要高，重建人免疫系统能力也比NOD scid IL2RγKO小鼠要弱，如果要提高BALB/c Rag1or2KO IL2RγKO小鼠重建人免疫系统的程度，需要经过更多的基因修饰。因此，BALB/c Rag1or2KO IL2RγKO小鼠在应用上不如NOD scid IL2RγKO小鼠广泛。以上所述重度免疫缺陷小鼠被统称为第一代重度免疫缺陷小鼠。

在重度免疫缺陷型小鼠体内重建人源化免疫系统通常是通过向小鼠体内植入人的造血干细胞(CD34+HSC)来实现的。一段时间后，人造血干细胞可在小鼠体内重建出各种免疫细胞，例如人T细胞、人B细胞、人髓系细胞等。人的免疫系统通常需要人细胞因子的支持才能分化成熟。但由于第一代重度免疫缺陷小鼠缺少人MHC分子，而且部分小鼠细胞因子和人细胞因子缺少交叉反应，因此在一代重度免疫缺陷小鼠体内重建的人免疫系统存在功能缺陷，例如髓系细胞比较少，淋巴组织发育不全，T细胞和B细胞功能不完善。

因此，不断有人尝试在重症免疫缺陷小鼠体内表达人细胞因子或可发挥与人细胞因子同等作用的工程化细胞因子。然而目前广泛用于重建人免疫系统的NOD scid IL2RγKO小鼠由于遗传背景的特性，其胚胎干细胞(ES细胞)不适于进行基因改造。而且这种小鼠的受精卵受孕率低，细胞核发育不成熟，也很难直接用于制作基因敲入或者过表达的转基因小鼠。由于对这种小鼠进行基因修饰的难度大，因此制作转基因重度免疫缺陷小鼠的方法通常是先对C57BL小鼠进行基因修饰，然后和NOD scid IL2RγKO小鼠连续回交10代。经过约两年后，C57BL遗传背景的转基因小鼠可转变为NOD scid IL2RγKO遗传背景的转基因小鼠。