[发明专利]一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用

说明书

本发明公开了一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用，该烯键还原酶突变体包括以SEQ ID NO.1所示野生型的烯键还原酶OYE2p为模板，第84位氨基酸残基发生突变形成的烯键还原酶突变体Y84A，Y84V，Y84L，Y84I，Y84T，Y84C，氨基酸序列如SEQ ID NO.3～8所示。根据本发明提供的烯键还原酶的突变体可高活性、高立体选择性催化柠檬醛制备(R)‑香茅醛，具有经济环保、手性选择性高的特点，为(R)‑香茅醛的工业化生产提供一个潜在的生物催化剂。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地涉及一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用。

背景技术

(R)-香茅醛((R)-(+)-Citronellal)，化学名为(3R)-3,7-二甲基-6-辛烯醛，化学结构式如(I)，是一种重要的香料及医药中间体，其可用于食品、日用品等调香，还可作为合成L-薄荷醇和维生素E的原料。目前，(R)-香茅醛主要由天然精油分离提取获得，也可由柠檬醛经金属催化剂催化加氢制得。

利用烯键还原酶催化柠檬醛不对称还原合成(R)-香茅醛与其它方法相比具有环境友好、反应条件温和、产物立体选择性高等优点。目前已报道的能够催化柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶极少，且催化活力普片偏低。Stewart等人获得一株源自Pichiastipitis的烯键还原酶OYE2.6，其可以在5.75h内催化150mM E-柠檬醛生成(R)-香茅醛，产物ee值达到98％【Chemical Communications,2010,46(45):8558-8560.】；但底物E-柠檬醛需由柠檬醛(E，Z-柠檬醛的混合物)分离获得。Hauer等人通过蛋白质工程手段对源自Zymomonas mobilis的烯键还原酶NCR进行改造，最终突变株W66A对E-柠檬醛的对映体选择性由99％(S)反转为46％(R)，但对Z-柠檬醛的对映体选择性仍仅为88％(S)，因此难以满足生产(R)-香茅醛的需要。因此，开发能够高活性、高选择性催化柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用，从而解决现有烯键还原酶催化合成(R)-香茅醛的技术存在立体催化活性偏低以及立体选择性不高的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种活性和立体选择性均提高的烯键还原酶突变体，包括以烯键还原酶突变体OYE2p作为模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将第84位氨基酸发生如下突变后的烯键还原酶突变体：第84位的酪氨酸Y突变为丙氨酸A的烯键还原酶突变体Y84A(SEQ ID NO.3)；第84位的酪氨酸Y突变为缬氨酸V的烯键还原酶突变体Y84V(SEQ ID NO.4)；第84位的酪氨酸Y突变为亮氨酸L的烯键还原酶突变体Y84L(SEQ ID NO.5)；第84位的酪氨酸Y突变为异亮氨酸I的烯键还原酶突变体Y84I(SEQ ID NO.6)；第84位的酪氨酸Y突变为苏氨酸T的烯键还原酶突变体Y84T(SEQ IDNO.7)；第84位的酪氨酸Y突变为半胱氨酸C的烯键还原酶突变体Y84C(SEQ ID NO.8)。

本发明以实验室前期构建保藏的烯键还原酶OYE2p(来源于Saccharomycescerevisiae YJM1341，参见文献Bioresour.Bioprocess.(2018)5:9)作为模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对其进行定点突变，从而得到在催化活力和立体选择性等方面显著改善的烯键还原酶突变体。

根据本发明的第二方面，提供一种如上所述的酶活及立体选择性提高的烯键还原酶突变体的编码基因，所述编码基因编码如上面所述烯键还原酶突变体所示的氨基酸序列。