[发明专利]一种堆肥中胞外DNA的提取方法

权利要求书

1.一种堆肥中胞外DNA的提取方法，其步骤包括：

1）取堆肥产品鲜样，加入聚乙烯聚吡咯烷酮，再加入胞外DNA提取剂震荡混匀，离心取上清液；其中，所述胞外DNA提取剂由Tris-EDTA、PEG 8000、NaH₂PO₄制成；所述胞外DNA提取剂中NaH₂PO₄的终浓度为0.05-0.15mol/L，Tris-EDTA的终浓度为25-75 mmol/L，PEG 8000的最终浓度为0.05-0.15g/ml，聚乙烯聚吡咯烷酮的最终浓度按堆肥产品鲜样质量的比例为1g:0.1g-2g，且所述堆肥产品鲜样与所述提取剂的混合质量比例为1g:5-15ml；

2）步骤1）中的上清液经过滤膜后再挤压通过硅胶填充柱去除有机质；所述硅胶是孔径为50-70 Å；

3）收集含有胞外抗性基因的滤液；

4）纯化获得纯化后的胞外抗性基因。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：重复步骤2）和3）2-5次，将获得的滤液合并用于步骤4），或者分别纯化后合并。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述震荡混匀是涡旋震荡混匀，转速为1000-2000r，震荡5-10min，随后冷冻离心，保留上清液，过孔径为0.22μm滤膜。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述硅胶是孔径为60Å。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：对步骤4）所述的纯化是对步骤3）中收集的滤液，加入DNA纯化剂混匀。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：所述纯化剂的成分是：配置50mmol/LTris–10 mmol/L EDTA混合液，将pH值调节至8.0，再添加CTAB使其浓度为1%；按照体积比为1:1加入DNA纯化剂。

7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：将加入DNA纯化剂的混合液，进行水浴加热，随后冷冻离心10min，轻轻倒去上清液，保留沉淀。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：将加入DNA纯化剂的混合液于65℃水浴中培养30min，随后在4℃条件下，转速10000g离心10min，轻轻倒去上清液。

9.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：将所述沉淀溶于高盐缓冲液，轻轻摇匀，直至沉淀完全溶解然后加入冷异丙醇于冰中培养1h，随后转速10000g，4℃，离心15min，轻轻倒去上清液；将沉淀溶于缓冲液中，获得提取的DNA样品溶液；

其中高盐缓冲液成分为：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，调节pH至8.0；所述冷异丙醇加入量为0.6倍体积，且预先在-20℃冰箱冷却30min；所述缓冲液的成分为：10 mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，调节pH至8.0。

10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于：还进一步包括对获得的DNA样品溶液进行洗涤的步骤。

11.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于：所述洗涤步骤如下：按照等体积加入DNA洗涤液，其中DNA洗涤液配置为25：24：1=苯酚：氯仿：异戊醇，随后转速10000g，4℃，离心5min，轻轻吸取上清液；再按照等体积加入DNA蛋白洗涤液，其中DNA蛋白洗涤液配置为24：1=氯仿：异戊醇，随后转速10000g，4℃，离心5min，轻轻吸取上清液。

12.根据权利要求11所述的提取方法，其特征在于：取经过洗涤后的上清液，加入冷的纯乙醇，并调节至最终样品中乙醇浓度为70%，在-20℃条件下培养1h，随后转速10000g，4℃，离心15min，轻轻倒去上清液，对沉淀，用75%乙醇清洗沉淀两次，真空干燥后，溶于缓冲液中。