[发明专利]一种堆肥中胞外DNA的提取方法

说明书

一种堆肥中胞外DNA的提取方法，所述的方法包括：采集堆肥鲜样，将Tris‑EDTA、PVPP、PEG 8000和NaH₂PO₄配置为胞外DNA提取剂，与堆肥样品混匀，随后通过硅胶填充柱去除有机质，收集含有胞外抗性基因的混合液并用于纯化，获得纯化后的胞外DNA可用于如通过qPCR技术检测抗性基因的种类和丰度。本发明不仅能够高效提取出胞外DNA样品，还能有效避免堆肥高浓度有机质对提取胞外DNA的干扰，相较于一般的提取方式，本发明提取的效率更高，为堆肥胞外抗性基因研究提供有力的支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域和环境保护领域，具体涉及到一种堆肥中胞外DNA提取，并用于抗性基因丰度的检测。

背景技术

堆肥是一种固废有机资源再利用的有效手段，减少有机固废污染的同时，回收利用有机废物中可利用的有机质。但有机固废中所含的残留抗生素，重金属，有机污染物和消毒剂等会诱导抗性基因的产生。其中，抗性基因在环境中有两种存在形式：胞内抗性基因和胞外抗性基因，胞内抗性基因会经过堆肥处理后丰度被削减，而胞外抗性基因能够被非耐药菌通过自然转化，从而导致抗性基因的水平转移，难以被彻底削减。

已有研究表明(Extracellular DNA in natural environments:features,relevance and applications[J].Appl Microbiol Biot,2018,102(15):6343-56.；Extracellular DNA in soil and sediment:fate and ecological relevance[J].BiolFertility Soils,2009,45(3):219-35.)胞外抗性基因可以在土壤和沉积物等环境中持续数月甚至数年，还能够通过吸附在土壤胶体、沙粒、粘土矿物和腐殖质上而避免核酸水解酶的破坏，因此胞外抗性基因会形成一个动态抗性基因库，会扩大抗性基因的潜在环境风险。目前对于胞内抗性基因已有诸多研究(如Persistence of extracellular DNA in riversediment facilitates antibiotic resistance gene propagation[J].Environ SciTechnol,2014,48(1):71-8.)以及相应的提取和检测方法，但是对于胞外抗性基因，特别是针对堆肥产品胞外抗性基因的提取方法还尚不成熟，这给堆肥过程中胞外抗性基因削减的研究造成了瓶颈。

为进一步研究堆肥中胞外抗性基因的分布特征和削减机制，寻找一种能够准确、便捷可行的堆肥中胞外DNA(其中可包括胞外抗性基因)的提取和检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种堆肥中胞外DNA的提取和检测方法，以期准确、便捷的提取出高质量的堆肥产品中胞外DNA，并用于检测相应抗性基因的丰度。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种堆肥中胞外DNA的提取方法，其步骤包括：

1)取堆肥产品鲜样，加入聚乙烯聚吡咯烷酮，再加入胞外DNA提取剂震荡混匀，所述胞外DNA提取剂由Tris-EDTA、PEG 8000、NaH₂PO₄制成；

2)随后通过硅胶填充柱去除有机质；

3)收集含有胞外抗性基因的滤液；

4)纯化获得纯化后的胞外抗性基因；

任选地，重复步骤2)和3)2-5次，优选为3次，将获得的滤液合并用于步骤4)，或者分别纯化后合并。