[发明专利]一种柠条锦鸡儿离体再生方法

说明书

本发明公开一种柠条锦鸡儿高效离体再生体系。以其胚尖作为起始材料，经合适的激素诱导产生大量不定芽，并在合适的激素下不定芽得以伸长，最终实现柠条的有效离体再生，可以不受季节限制获得大量的再生植株，为柠条遗传转化奠定基础。本发明建立的柠条胚尖高效离体再生方法促进柠条种苗规模化繁殖，为柠条优良性状植株培育、植物抗逆性分子机理研究等提供技术保障，弥补柠条育种领域的空白。

技术领域

本发明涉及植物组织培养和生物技术领域，具体为一种柠条锦鸡儿离体再生方法。

背景技术

柠条(Caragana korshinskii)属豆科锦鸡属落叶大灌木，又叫毛条、白柠条，是一种生长在荒漠、半荒漠地区多年生灌木(王赞,高洪文,韩建国.柠条锦鸡儿DN A提取及AFLP反应体系的建立[J].草地学报,2005,13(2):126-129)。随着沙漠化治理工作的快速推进，锦鸡儿属植物作为荒漠区的优势植物，得到了高度重视。柠条对沙地环境有很强的适应能力，是防风固沙、保持水土、改善土壤微量元素含量、具有较高饲用及药用价值且表现出极强的抗逆性和适应性，不仅成为优良的生态、经济树种，还为植物抗逆性研究提供良好的材料(牛西午.柠条生物学特性研究[J].华北农学报，1998，13(4)：122-129)。

目前对柠条的研究多围绕其生态价值、生理生态、形态结构以及抗逆分子机理等方面，对其高效稳定再生体系建立报道甚少，迄今为止，柠条在组培方面相关研究都是以茎段、子叶节、上胚轴、下胚轴为外植体进行不定芽诱导。高玫等以柠条的上胚轴、下胚轴(或幼茎)直接诱导出不定芽(高玫,李天然.几种野生豆科锦鸡儿属(Caragana Fabr.)植物离体培养过程中器官分化和内源植物激素含量的关系[J].内蒙古大学学报(自然科学版),1990(03):127-137+162)；宋俊双等以柠条锦鸡儿无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，诱导出愈伤组织和直接诱导出不定芽并生根(宋俊双,王赞,孙桂芝,等.柠条锦鸡儿的组织培养[J].草地学报,2007,15(1):66-66)。慈忠玲等以柠条锦鸡儿的子叶和胚轴为外植体进行愈伤组织诱导(慈忠铃.柠条锦鸡儿愈伤组织的培养和分化[J].内蒙古林学院学报,1998,20(12):15-19)；邵玲玲以柠条茎段为外植体，建立一套较为完整的快繁体系(邵玲玲.柠条锦鸡儿组织培养技术[J].农业系统科学与综合研究(4):469-474)。但总体来说，柠条离体再生处于尝试阶段，其遗传转化受限的关键因素是缺乏高效的离体再生体系。

因此，开展柠条离体培养和植株再生研究刻不容缓，为培育创制转基因柠条新品种，实现柠条分子育种提供技术支持。

发明内容

为了解决上述瓶颈问题，本发明人开展柠条离体再生研究，最终获得柠条离体再生体系。

发明人尝试以不同的外植体(如茎段、胚尖、下胚轴)做为起始材料进行研究探索，最终确定以柠条胚尖为外植体，建立柠条离体再生体系，实现柠条高效离体再生。目前采用胚尖作为外植体及其诱导培养实现离体再生，无论是柠条还是其他锦鸡儿属植物均尚未见报道。

本发明提供一种柠条锦鸡儿离体再生方法，其包括如下步骤：

(1)无菌苗的制备：将消毒的柠条种子接种至MS培养基中进行培养。优选地，第(1)步骤的具体操作：挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条种子，消毒接种至MS培养基中。其中，消毒方式在超净台外用洗洁精清洗3min，75％回收酒精棉花包裹擦拭种子，进入超净台后再用75％回收酒精过一下后，用75％酒精消毒2min，最后用10％次氯酸钠消毒20min；

(2)不定芽诱导预培养：选取(1)中培养4-10d的无菌苗，切取胚尖接种至不定芽诱导预培养培养基上，所述不定芽诱导预培养培养基优选为MS改良培养基(MS培养基的大量元素和微量元素以及B5培养基的有机成分，后面简称MSB₅培养基)，并添加6-苄氨基嘌呤(BA)0.1-1mg/L和萘乙酸(NAA)0.01-0.1mg/L，优选地BA添加量为0.4-0.6mg/L、NAA为0.04-0.06mg/L，光下培养7-25d，优选为10-20d，最优选为14-16d；