[发明专利]一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法

权利要求书

1.一种胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，其包含胆碱类物质和缓冲液；

所述胶乳免疫比浊第二试剂还包含连接抗体的胶乳微球，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体或尿转铁蛋白抗体；

当所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体时，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比为0.05~1%；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比为0.1~1%；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度为50~80mmol/L，pH为7~9；所述羧基微球粒径为180~250nm，或，

当所述抗体为尿转铁蛋白抗体时，所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比为0.7-2%；所述biolipidure405的质量体积比为0.05-1%；所述N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度为70~120mmol/L，pH为7~8；所述羧基微球为粒径60~90nm和300~400nm两种粒径微球的组合。

2.如权利要求1所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，

当所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体时，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比为0.75%；和/或，所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比为0.6%；和/或，所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度为70mmol/L，pH为8.5。

3.如权利要求1所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，

当所述抗体为尿转铁蛋白抗体时，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比为1.5%；和/或，所述biolipidure405的质量体积比为0.7%；和/或，所述N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度为90mmol/L，pH为7.5。

4.一种组合物，其特征在于，其含有如权利要求1~3任一项所述的胶乳免疫比浊第二试剂。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为溶液形式，所述组合物还包含第一试剂；或，

所述组合物为试剂盒形式，所述组合物还含有独立地第一试剂；

所述第一试剂包含磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液。

6.一种如权利要求1所述的胶乳免疫比浊试剂的第二试剂的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

当所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体时，

（1）制备中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物：用3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和180-250nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.03:0.01:1，室温混合30min后，离心去上清；在沉淀中加入3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液进行重悬，加入鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白单克隆抗体，缓冲液与抗体的体积比为5:0.12，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物；

（2）制备胆碱溶液：在50-80mmol/L pH为7-9的N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中，添加0.05-1%的戊酰左旋肉碱和0.1-1%甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；

（3）制备第二试剂：在步骤（1）制备的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物中，添加步骤（2）制备的胆碱溶液并进行重悬，即得到中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白胶乳试剂；

当所述抗体为尿转铁蛋白抗体时，

（1）制备尿转铁蛋白抗体-微球偶联物，使用两种胶乳微球与两种抗体进行标记：

（1-1）用3-吗啉丙磺酸缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和60-90nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.02:0.04:1，室温混合30min后，离心去上清；在沉淀中加入3-吗啉丙磺酸缓冲液进行重悬，加入兔抗人尿转铁蛋白多克隆抗体，缓冲液与抗体的体积比为5:0.08，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得尿转铁蛋白抗体-小粒径微球偶联物；（1-2）用二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和300-400nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.01:0.01:1，室温混合30min后，离心去上清；在沉淀中加入二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷缓冲液进行重悬，加入羊抗人尿转铁蛋白多克隆抗体，缓冲液与抗体的体积比为5:0.15，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得尿转铁蛋白抗体-大粒径微球偶联物；

（2）制备胆碱溶液：在70-120mmol/L pH为7-8的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲液中，添加0.7-2%的琥珀酰左旋肉碱锂盐和0.05-1% biolipidure405；

（3）制备第二试剂：在步骤（1）制备的尿转铁蛋白抗体-微球偶联物中，抗体-小粒径微球偶联物和抗体-大粒径微球偶联物添加步骤（2）制备的胆碱溶液并进行重悬，即得到尿转铁蛋白胶乳试剂，大小粒径偶联物与溶液体积比为2.5:1:50。