[发明专利]一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用

权利要求书

1.一种含有透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于，先构建含有天然透明质酸酶编码基因的重组质粒，然后导入大肠杆菌感受态细胞，经过筛选得到重组大肠杆菌，并对重组大肠杆菌进行固定化而得到该固定化细胞。

2.根据权利要求1所述透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于，基于易错PCR技术的酶体外进化技术，以重组质粒pET28(a+)-PF为模板，使用易错PCR技术，获得含有碱基突变的线性基因片段，将PCR产物和pET28a(+)表达质粒分别进行双酶切（EcoRI、NotI）、纯化、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，然后进行PCR验证和诱导表达，经过大量筛选获得酶活单位明显提高的突变株。

3.权利要求1所述透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞的制备方法如下，其特征在于，含有如下步骤：

第一步合成Penicilliumfuniculosum天然透明质酸酶编码基因（GenBank:AB355480），通过EcoR I和Not I酶切位点连接至质粒pET28(a+)得到重组质粒pET28(a+)-PF；

第二步采用热激转化法（42 ℃处理90秒后冰浴5分钟）将重组质粒pET28(a+)-PF转化感受态大肠杆菌细胞E.coliDH5α，经过卡那霉素抗性筛选获得含有透明质酸酶的重组大肠杆菌E.coliDH5α-pET28(a+)-PF；

第三步挑取E.coli DH5α-pET28(a+)-PF单菌落接入Luria-Bertani培养基（LB培养基），37℃，220 r/m活化培养15 h左右，应用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒pET28(a+)-PF；

第四步采用热激转化法（42 ℃处理90秒后冰浴5分钟）将重组质粒pET28(a+)-PF转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经过卡那霉素抗性筛选获得含有透明质酸酶的重组大肠杆菌E.coliBL21-pET28(a+)-PF；

第五步E.coli BL21-pET28(a+)-PF发酵培养，具体如下：

培养基制备：配制Luria-Bertani培养基（LB培养基），卡那霉素终浓度为50～100 mg/L；

种子培养：挑取重组大肠杆菌单菌落接种至步骤（一）培养基，37 ℃，220 r/m震荡培养8～15 h；

发酵培养：以2～6 %接种量接种至步骤（一）培养基，37 ℃，220 r/m震荡培养至发酵液在600 nm处吸光度值（OD₆₀₀）达到0.6～1.0；

诱导表达：加入终浓度为0.05～0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），18～25 ℃下诱导表达8～12 h；

后处理：首先，将发酵液在8000～12000 r/m离心10～20 min，弃掉上层清液；然后，将下层菌体用0.85 %氯化钠溶液震荡悬浮，8000～12000 r/m离心10～20 min一次，弃掉上层清液；接着，再用0.85 %氯化钠溶液重复洗涤、离心一次；最后，用1/20～1/10原始发酵液体积的0.85%氯化钠溶液悬浮菌体，得到湿菌体细胞；

第六步制备固定化细胞，具体如下：

制备固定化载体：分别称取海藻酸钠0.5～6 g，聚乙烯醇1～10 g，用100～150 mL热水溶解，115℃灭菌20 min，冷却至室温；

制备固定化细胞：将第五步（五）得到的湿菌体细胞与上一步骤的固定化载体，按照1:1～1：10体积比充分混合，将该混合液逐滴加入0～4℃ 0.1～4 %氯化钙和1～5 %硼酸溶液中进行固化，然后置于0～4℃下冷却成型12～24 h，控制固定化颗粒粒度2～10 mm；

过滤洗涤：用200～300目筛网过滤固定化细胞，无菌水冲洗2～3次。

4.权利要求1所述透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞在制备微分子（5000-10000Da）透明质酸或其盐中的应用，其特征在于，含有如下步骤：

第一步配制浓度为2～5%（m/V）的高分子量（1000 KDa～2000 KDa）透明质酸或其盐溶液；

第二步加入10～30 %（m/V）比例的第六步所得固定化细胞，在30～40 ℃、100～150 r/m条件下反应4～10 h，反应完全后，将反应液用200～300目筛网过滤，分别得到微分子透明质酸或其盐溶液和固定化细胞颗粒；

第三步用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤固定化细胞后，置于4℃冰箱保存，使用截留分子量为3 KDa的超滤膜浓缩低分子量透明质酸或其盐溶液，然后将浓缩液进行减压干燥，待水分＜5%后，粉碎、过100目筛得到微分子透明质酸钠。