[发明专利]一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用

说明书

本发明涉及一种重组大肠杆菌固定化细胞及在微分子透明质酸或其盐制备上的应用。本发明的技术方案是一种含有透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞，先构建含有天然透明质酸酶编码基因的重组质粒，然后导入大肠杆菌感受态细胞，经过筛选得到重组大肠杆菌，并对重组大肠杆菌进行固定化而得到该固定化细胞。本发明提供了一种重组大肠杆菌固定化细胞及在微分子透明质酸或其盐制备上的应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组大肠杆菌固定化细胞及在微分子透明质酸或其盐制备上的应用。

背景技术

透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸组成的双糖单位重复构成的无分支糖胺聚糖，存在于动物细胞间质和某些细菌荚膜中，在化妆品、食品、医药领域具有广泛的应用。按照分子量大小，可将透明质酸或其盐分为大分子（1800～3000 kDa）、中分子（1000～1800 kDa）、小分子（10～1000 kDa）、微分子（10 kDa以下），不同分子量的透明质酸具有不同的锁水、渗透、生物活性功能。中、小分子量透明质酸有助于蛋白和多肽类物质的运输，应用于慢性伤口愈合，微分子透明质酸可以渗透至皮肤基底层，有效抑制炎症因子释放，缓解各种因素引起的皮肤敏感状态，清除自由基，修复紫外线或化学物质刺激造成的皮肤细胞损伤，实现深层保湿和修复受损细胞，还可以通过破坏受体和透明质酸的结合杀死许多种类的癌细胞。

随着低分子透明质酸的应用推广，其降解及制备技术成为研究的热点。常见的降解方法有物理降解，如加热、超声破碎法、辐射等；化学降解，如氧化水解、酸水解、碱水解等，但是这两种降解方法存在寡糖分子量分布范围广、纯化程序复杂、寡糖结构易被破坏、对设备要求高等缺点，降低了特定分子量寡糖的制备效率，难以在工业规模大量生产。而生物酶法制备低分子透明质酸的反应条件温和、制备效率较高。

专利CN 103255187 B公开了一种制备低分子透明质酸的方法，由保藏号为CGMCCNo.5744的芽孢杆菌发酵生产的透明质酸酶，对分子量大于1000 kDa的透明质酸或其盐进行降解，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁶～10⁷ IU，其制备步骤包括芽孢杆菌种子培养、芽孢杆菌发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水、干燥。

专利CN 109897876 B公开了一种小分子透明质酸或其盐的制备方法，使用由菌种保藏号CGMCC No.16836的植物乳杆菌发酵生产的透明质酸酶，酶解分子量500 KDa～700KDa透明质酸或其盐，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁵～10⁸ IU，其制备步骤包括植物乳杆菌种子培养、发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、活性炭吸附除杂、过滤微孔滤膜、低温喷雾干燥得到小分子透明质酸或其盐。

专利CN 110331178 B公开了一种酶切法制备小分子透明质酸的方法，使用保藏号CCTCC NO：M 2018452的球形节杆菌HL6发酵生产的透明质酸酶，酶解分子量大于600 KDa透明质酸或其盐，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁵～5*10⁸ U，其制备步骤包括球形节杆菌种子培养、发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水、干燥。

专利CN 104263666 B公开了一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶has A和枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD，在重组毕赤酵母宿主中实现透明质酸的生产，同时，采用水蛭来源的透明质酸酶整合至毕赤酵母基因组上，分别置于不同强度的组成型启动子下分泌表达，通过控制透明质酸酶的分泌量来制备不同分子量大小的小分子透明质酸。以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖为碳源，20～30℃下发酵48～96 h。