[发明专利]一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，其制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，其特征在于，所述载体的T-DNA区由5’端向3’端依次包含一个愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒和一个带有多克隆位点的报告基因表达盒；

所述愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒包括一个愈伤组织特异启动子、筛选标记基因编码序列和终止子；

所述愈伤组织特异启动子优选为LOC_Os10g14020基因启动子。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒由5’端向3’端依次包含愈伤组织特异启动子、筛选标记基因编码序列和终止子；

优选的，所述愈伤组织特异启动子的两端均设置有AscI酶切位点。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述愈伤组织特异启动子驱动的潮霉素基因表达盒由5’端向3’端依次包含终止子、筛选标记基因编码序列和愈伤组织特异启动子，所述愈伤组织特异启动子反向靠近所述报告基因编码序列；

优选的，愈伤组织特异启动子的两端均设置有AscI酶切位点。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述报告基因选自糖苷水解酶基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因；所述糖苷水解酶基因优选β-葡萄糖苷酸酶基因，所述荧光素酶基因优选荧火虫荧光素酶基因，所述荧光蛋白基因优选绿色荧光蛋白基因；

所述筛选标记基因选自潮霉素磷酸转移酶基因、抗生素标记基因或抗化学试剂标记基因，抗生素标记基因优选抗卡那霉素基因，所述抗化学试剂标记基因优选抗除草剂基因。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述报告基因表达盒包括β-葡糖醛酸酶基因编码序列和胭脂碱合成酶基因终止子。

6.根据权利要求1～5任一项所述的载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

7.含有如权利要求1所述载体的重组质粒、宿主菌或转基因株系；

优选的，所述重组质粒为含有QHB、CYCB、DR5或PR1b启动子的重组质粒。

8.采用如权利要求1～6任一项所述的载体在水稻中分析植物基因启动子表达特异性的方法，至少包括以下步骤：

S1、将目的基因上游启动子片段或合成的启动子片段连入所述载体中的报告基因前的多克隆位点，得到重组质粒；所述目的基因上游启动子片段或合成的启动子片段选自QHB、CYCB、DR5和PR1b启动子中的至少一种；

S2、将所得重组质粒通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，在含有30～60mg/L、优选50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤并分化成苗。

9.如权利要求1～6任一项所述的载体的制备方法，至少包括以下步骤：

S1、PCR扩增各个载体组件序列，所述载体组件序列包括愈伤组织特异启动子、筛选标记基因编码序列、报告基因及终止子；

S2、将各个DNA片段按照所述载体的排列方式进行连接。

10.如权利要求1～6任一项所述的载体在分析特异性表达外源基因中的应用。