[发明专利]一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，其制备方法及应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体讲，涉及一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，其制备方法及应用。该载体的T‑DNA区由5’端向3’端依次包含一个愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒和一个带有多克隆位点的报告基因表达盒；愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒包括一个愈伤组织特异启动子、筛选标记基因编码序列和终止子。本发明的载体利用水稻愈伤组织特异启动子驱动筛选标记基因表达，能大大减少对目的基因启动子的非特异互作，提高目的基因表达的特异性，并能有效降低转基因植物中筛选标记基因引发的生物安全风险，在基础理论研究和分子育种中均具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体讲，涉及一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，其制备方法及应用。

背景技术

利用转基因技术在植物中研究基因功能和培育生物安全的转基因作物需要准确的表达目的基因，但实际上独立的转基因株系间常常会表现出不同的基因表达水平及遗传性状(HansenWright,1999)。这种无意间引入的与目的基因无关的影响主要来自两个方面：一是转基因过程中T-DNA插入位置的不同引起的转基因序列与外部旁侧基因序列之间的互作，称为位置效应；二是转基因载体本身携带的选择标记基因及驱动选择标记基因表达的调控元件对转基因表达的影响，称为多向效性(Miki et al.,2009)。

解决位置效应的有效方法是开发定点插入的转基因技术，随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅速发展，定向敲除基因变成了容易掌握的常规实验手段，定向敲入基因也有不少成功的报道(Li et al.,2016)。但相比定向敲除，定向敲入的方法在插入位置和插入效率上还有很大的局限性，目前还不能得到广泛的应用。而由载体本身引起的目的基因表达的多向效应主要体现在选择标记基因及相应启动子的使用上。一个灵敏的选择标记基因的高效表达是转基因成功的关键，因此转化载体往往采用强启动子来表达选择标记基因，如烟草花叶病毒(CaMV)的35S启动子。这类转化载体包括常用的pCAMBIA载体系列、pPZP载体系列和Gateway的pGWB载体系列等。但是越来越多的实验表明，35S启动子具有双向启动子活性，对其上下游的启动子元件均能产生干扰，严重影响它们的表达强度和时空特异性。

为了减少启动子之间的互作造成的异位表达，Gudynaite-Savitch等用从烟草中分离的tCUP启动子序列驱动卡那霉素抗性基因NPTII进行拟南芥转化子的筛选，证明在双子叶植物中tCUP启动子具有比35S更高的活性(Malik et al.,2002)，且不影响相邻的种子特异启动子的正常表达(Gudynaite-Savitch et al.,2009)。通过研究tCUP1启动子在水稻中的表达特性，发现它能驱动潮霉素抗性基因HPTII的表达并进行抗性愈伤的筛选(Zhouet al.,2013)。通过研究tCUP1启动子对生长素应答启动子DR5在水稻根尖表达特异性的影响，证明它在水稻中同样具有严谨的调控机制(Zhou et al.,2014)。但美中不足的是tCUP1启动子在水稻中的活性要小于35S启动子，抗性愈伤生长缓慢，筛选时间明显延长，影响了后期的分化和成苗，不能满足大规模基因表达分析的要求。

因此，开发在水稻中具有较高表达活性和严谨性的调控元件介导筛选标记基因的表达具有重要意义。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种用于分析植物启动子表达特异性的载体。

本发明的第二发明目的在于提供该载体的应用。

本发明的第三发明目的在于提供该载体的制备方法。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于分析植物启动子表达特异性的载体，所述载体的T-DNA区由5’端向3’端依次包含一个愈伤组织特异启动子驱动的筛选标记基因表达盒和一个带有多克隆位点的报告基因表达盒；