[发明专利]促使iPSC分化为中枢神经干细胞的方法及培养基和系统

说明书

本发明公开了一种促使诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的方法及培养基和系统，在诱导多能干细胞的培养过程中使用玻连蛋白处理的细胞培养器皿，在诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的过程中使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用低动物源性或无动物源性的中枢神经诱导培养基进行培养。对比现有方法，本专利工艺显著优化，一种培养基即可制备高纯度的中枢神经干细胞，培养基化学成分明确，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，工艺整体可做到无动物源性，避免了动物源性致病因子污染风险，适用于大的表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的中枢神经干细胞产量，有利工业化生产。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种促使诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的方法及培养基和系统。

背景技术

中枢神经系统的神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)在疾病治疗、药物研发、科学研究等领域有巨大应用潜力，疾病治疗和药物研发都需要大量高纯度的NSC。现有的NSC获得方法可分为两类，分别是组织提取法和干细胞分化法。其中，组织提取法从胚胎组织中提取NSC，但因为可供使用的胚胎组织来源有限且每批次的组织因发育程度不同而质量参差不齐，并有着较大的道德争议，其应用难以普及；干细胞分化法主要通过体外分化手段，将胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或诱导多能干细胞(Induced PluripotentStem Cell，iPSC)分化为NSC。然而，现有体外分化方法大多工艺复杂、耗时较长，需要将多种试剂/细胞培养基联合或按照一定顺序使用，随着试剂/培养基种类的上升，工艺整体的成本将上升，而多种试剂/培养基的配制和联合/顺序使用更增加了整个工艺流程的操作难度和出错的风险，不利工业生产，限制了NSC的应用，所得到的NSC批次间质量差异较大，分化过程所使用的试剂和物料种类繁多，其中更包含了牛血清、牛血清白蛋白、鼠源细胞分泌物(基质胶，Matrigel)等大量的动物源性成分，带来了动物病原体污染等风险，不利于包括临床治疗在内的各类应用。因上述情况，以现有干细胞分化法制备得到的NSC，和工业规模生产和实际临床应用仍有较大的距离。另一方面，ESC本身的获得需要消耗胚胎组织，也存在一定的道德争议。此外，现有技术多用于科学研究，未尝试摸索NSC大量生产的方法，未能满足工业生产和治疗应用的需求。

综上，NSC的获得途径有限，制备工艺步骤较为复杂，使用物料种类繁多，制备耗时较长，导致了制备成本高、产量低，局限了NSC的应用，亟需一种制备过程简化、制备时间短、成本低、污染风险小、产量和纯度高、利于工业化生产的分化方法和培养基。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的方法及培养基和系统，在诱导多能干细胞的培养过程中使用玻连蛋白处理的细胞培养器皿，在诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的过程中使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用低动物源性或无动物源性中枢神经诱导培养基进行培养。

本发明提供一种促使诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞的方法，包括以下步骤：

S1：诱导多能干细胞的培养；

包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；

S2：诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞；

开始分化前，将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用低动物源性中枢神经诱导培养基或无动物源性中枢神经诱导培养基进行培养，更换培养基，培养8～10天，以胰酶替代物对诱导多能干细胞分化后得到的中枢神经干细胞进行处理，收集中枢神经干细胞。