[发明专利]一种单细胞内抗原的无线电化学可视化分析方法

说明书

电化学显微镜在过去的几十年中逐渐发展起来，用于单细胞生物分子的成像；然而，在单个细胞内实现胞内蛋白的电化学可视化是很困难的。本申请首次使用无线双极电化学发光技术(BPE‑ECL)观察了MCF 7细胞细胞核内的一个模型蛋白(KDM1/LSD1抗原)。亚微米尺寸的单壁碳纳米管与抗体相连接，用于识别相应的KDM1/LSD1抗原。在1000V/cm的低电场下，L012(鲁米诺类似物)在纳米管的阳极端被电化学氧化，发射出ECL信号，以实现其位置的无线可视化。在使用足够低的外加电压的情况下，可以观察到单个细胞内细胞核上的双极ECL发射，支持单个细胞内KDM1/LSD1抗原的电化学成像。

技术领域

本申请属于电化学发光领域，具体涉及一种单细胞内抗原的无线电化学可视化分析方法。

背景技术

单细胞内蛋白质的特异性检测对于阐明细胞生物学的分子机制和疾病诊断具有重要意义。

荧光成像是一种常用的检测质膜和活细胞内部蛋白质的可视化方法。然而，背景荧光的存在影响了这些蛋白质的定量分析。电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)作为一种近零背景的光学技术，被广泛应用于血清和细胞中各种抗原灵敏和定量的检测。在此过程中，发光基团(如Ru(bpy)₃²⁺)被标记在与相应抗原特异性结合形成免疫复合物的抗体上。在一定电压下，电极表面附近的发光体被激发产生中间体，中间体进一步与共反应物反应发射出ECL信号。然后通过显微镜和科研相机记录ECL信号，实现了抗原在单细胞质膜上的可视化。尽管ECL成像技术有了巨大的发展，但仍需要细胞与电极直接接触，这导致在单细胞内观察胞内蛋白很困难。因此，开发一种无线的电化学方法来实现单个细胞内蛋白质的可视化是电化学分析领域的一项长期任务。

双极电化学(BPE)是一种成熟的无线方法，它可在足够高的电场中使没有导线连接的导电物体产生极化，从而诱导了物体两端发生相应的电化学反应。这种方法不需要电极与细胞直接接触，允许细胞内的无线电分析。近年来，BPE-ECL已成功地用于分析生物分子和细胞表面的蛋白质。然而，BPE-ECL在单细胞内的进一步应用仍然具有挑战性。

原则上，要在一个细胞内实现BPE分析，导电物体必须小到亚微米尺度，这样它才能进入到细胞中。然而BPE有一个物理限制：即导体越短，所需施加的电压越大，才能使其极化并诱导ECL反应。理论计算得到，要在亚微米级的导体上诱导BPE-ECL反应，必须施加数万伏甚至更高的电压，这个电压不易操作。此外，这种高电压还会导致剧烈的水电解，在细胞介质中形成大量气泡，影响成像过程。

赖氨酸特异性去甲基化酶1(也可称为KDM1/LSD1)高表达会阻碍细胞分化，导致急性髓系白血病预后不良。

发明内容

为解决现有技术的上述问题，本申请提供一种单细胞内抗原的无线可视化分析方法，利用BPE-ECL实现了单个细胞内蛋白质的无线电化学可视化。

本申请提供一种单细胞内抗原的无线可视化分析方法，包括以下步骤：

首先，将单臂碳纳米管标记在抗体上，将标记后的抗体与细胞共同孵育，使标记后的抗体进入细胞内，并与胞内对应的抗原结合；

然后，用多聚甲醛将细胞固定，用曲拉通X-100使细胞通透；

最后，将处理好的细胞包埋在含有发光试剂和缓冲溶液的琼脂糖水凝胶内

此时，水凝胶中的混合液可通过通透的细胞膜进入到细胞内，通过馈电级在凝胶内施加电压，诱导细胞内的发光试剂在单壁碳纳米管上发生双极电化学发光反应，最终成像，实现细胞内抗原可视化。

在一实施例中，所述抗体为KDM1/LSD1抗体或癌胚抗原的抗体。

在一实施例中，所述细胞为人乳腺癌细胞。

在一实施例中，发光试剂为鲁米诺或其类似物。