[发明专利]低分子肝素糖链序列检测方法、系统及测序试剂盒

说明书

本发明公开了一种低分子肝素糖链序列检测方法、系统及测序试剂盒，检测方法包括：样品制备步骤：根据实验需求分离或制备一组低分子肝素寡糖混合物样品；样品处理步骤：对低分子肝素寡糖混合物样品进行完全酶解和亚硝酸降解，分别获得酶解的8种基本组成单元数组和3‑O‑硫酸数组及内醚数组、亚硝酸降解数组等；数据处理步骤：根据酶解的8种基本组成单元数组及亚硝酸降解数组获得二糖异构单元数组；数据库构建步骤：根据寡糖聚合度、二糖异构单元数组、3‑O‑硫酸数组及内醚数组构建序列数据库；检测结果输出步骤：根据输入的限定条件信息通过序列数据库进行筛选，输出结果文件。通过本发明可实现一组肝素寡糖混合物的快速序列测定。

技术领域

本发明涉及低分子肝素糖链检测，具体地说，尤其涉及一种计算机软件辅助用于低分子肝素类药物的糖链序列测定的低分子肝素糖链序列检测方法、系统及测序试剂盒。

背景技术

在药物化学领域，糖类药物越来越受到重视，结构表征是其中重要的环节。然而天然多糖因其结构的复杂性及异质性，缺乏有效的序列分析方法，严重限制其构效关系研究和药物质量控制。糖链序列的鉴定一直是糖类药物研究的重难点，这在低分子肝素类药物的研究中尤其明显。

肝素(Heparin)是一种由L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸(1→4)D-葡萄糖胺二糖单元组成的具有多分散性的线性多糖，因其具有和抗凝血酶III特异性结合的序列而具有促进抗凝血活性的生物功能。低分子肝素(Low molecular weight heparins,LMWHs)是由肝素通过不同的降解条件得到的一类具有较低分子量的抗凝血药物，根据工艺和结构不同，包括依诺肝素钠(Enoxaparin sodium)、那屈肝素钙(Nadroparin calcium)、达肝素钠(Dalteparin sodium)等品种，与肝素相比，LMWHs具有生物利用度高、抗血栓作用强、血浆半衰期长、降低出血风险优点，是临床上广泛使用的一类抗凝血药物。肝素的二糖重复单元在糖醛酸残基上可能发生2-O-硫酸基取代，在葡萄糖胺残基上可能发生N-乙酰基取代、N-硫酸基取代、6-O-硫酸基取代和3-O-硫酸基取代。肝素的降解过程也会使糖链末端发生改变，因此低分子肝素是高度异质性的混合物，具有复杂的分子结构，其寡糖序列的鉴定是低分子肝素类药物研究的重难点。

现有的低分子肝素类药物糖链测定方法，主要是利用质谱及核磁技术，对低分子肝素药物进行单糖组成分析、二糖及基本组成单元分析、部分酶解的寡糖片段分析、完整糖链分析等。这些分析方法主要针对低分子肝素混合物进行分析，对其进行整体表征，并不能获得各糖链的序列信息。

针对肝素及低分子肝素的糖链序列测定，研究方法主要包括从天然混合糖链中通过复杂的分离方法获得单一糖链，或者通过合成的方法获得纯品，然后用质谱或者核磁等方法进行结构解析。

常用的糖链分离纯化方法包括：尺寸排阻色谱(size exclusionchromatography，SEC)，亲和色谱(affinity chromatography)、强阴离子交换色谱(stronganion exchange，SAX)，反相离子对色谱(reversed-phase ion pair，RPIP),亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)和毛细管电泳(and capillaryelectrophoresis，CE)等。通过上述一种或多种分离技术，对复杂混合肝素糖链进行分离，获得相对较纯的糖链，然后使用多种分析方法，如质谱和核磁，对糖链序列进行测定。由于低分子肝素糖链结构的复杂性和异质性，通常对肝素糖链的分离需要复杂的操作步骤，耗费大量科研人员的时间和精力，但是即使如此，也依然难以获得足够的纯品用于糖链序列的分析。现有的肝素糖链合成研究进展缓慢，目前依然难以实现肝素类糖链的化学或生物合成。