[发明专利]一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的RT‑PCR试剂盒。本发明通过对核酸释放条件、阳性和阴性对照荧光RT‑PCR条件、核酸样本的荧光RT‑PCR反应条件的优化，制备得到新型冠状病毒的RT‑PCR试剂盒，且与与现有的检测试剂盒相比明显缩短检测时间，提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒。

背景技术

新冠病毒的核酸检测是对不同程度的临床以及疑似患者等各类人群进行快速筛查的有效手段，其结果可作为临床诊断的最直接证据。根据国家《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》明确指出，病例确诊的病原学证据包括实时荧光RT-PCR监测新型冠状病毒核酸阳性和病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源。目前实时荧光RT-PCR检测具备灵敏度高、特异性强的特点，是应用较为广泛的核酸检测方法，特别适用于大范围筛查。

随着检测工作的大量开展，核酸检测试剂盒阳性检出率仅仅为30％～50％，多例疑似患者是经过核酸检测2～3次才呈现阳性结果，而且部分患者甚至已出现明显症状，但核酸检测仍然多次为阴性；还有出院患者发生复阳现象。这其中的原因不仅包含了采样时间、采样手法及样本运输等各个环节，不同的核酸检测试盒以及提取方式也是出现假阴性结果的重要因素。因此，亟需研发出阳性检出率更高的新冠核酸检测试剂盒。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，采用本发明的试剂盒大大缩短了检测2019-nCoV病毒的时间，提高了检测效率和检出精准度。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述试剂盒包含2019-nCoV RT-PCR检测反应液，所述2019-nCoV RT-PCR检测反应液包含ORF1ab基因、N基因和RNase P基因的特异性引物；所述ORF1ab基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述N基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述RNase P基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步，所述2019-nCoV RT-PCR检测反应液还包含ORF1ab基因、N基因和RNase P基因的探针，所述ORF1ab基因的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述N基因的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述RNase P基因的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步，所述ORF1ab基因探针的5’修饰为FAM，3’修饰为BHQ1；所述N基因探针的5’修饰为HEX，3’修饰为BHQ1；所述RNase P基因探针的5’修饰为Cy5，3’修饰为BHQ3。

进一步，所述2019-nCoV RT-PCR检测反应液还包括Buffer、RNase Free dH2O，所述试剂盒还包括RT-PCR酶、2019-nCoV阳性对照品、2019-nCoV阴性对照品、2019-nCoV样本核酸释放剂A液和2019-nCoV样本核酸释放剂B液。

进一步，所述RT-PCR酶为Taq酶和反转录酶。

进一步，所述2019-nCoV阳性对照品为浓度为10⁶copies/mL的2019-nCoV-CDC阳性质粒，所述2019-nCoV阴性对照品为RNase Free dH2O，所述2019-nCoV样本核酸释放剂A液由氢氧化钠，曲拉通X-100，Tris-HCl，乙基苯基聚乙二醇，吐温20，氯化钠，氯化钾，蛋白酶K，十二烷基硫酸锂制备而成，所述2019-nCoV样本核酸释放剂B液由曲拉通X-100，Tris-HCl，吐温20，乙基苯基聚乙二醇，氯化钠，氯化钾制备而成。