[发明专利]一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种G‑四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用。该方法包括对G‑四链核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置的核苷酸替换、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，本发明提供了由该修饰方法得到的产品及其在制备抗肿瘤药物，特别是抗多药耐药肿瘤药物、肿瘤检测试剂或作为细胞内分子调控工具中的应用。此修饰方法可广泛应用于各类G‑四链核酸适配体中，为其作为药物、检测试剂及细胞内分子调控工具的开发提供新的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法，其中包括对核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T/U)、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，本发明还提供了由上述方法获得的产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

核酸适配体(aptamer)多为长度15-80个核苷酸的单链DNA或RNA序列，自身可折叠形成稳定的三维结构，进而特异性地通过静电相互作用、氢键、范德华力、碱基堆叠作用等实现与靶标分子(包括金属离子、有机小分子化合物、核酸、蛋白质等)的诱导契合，被誉为化学“抗体”。

核酸适配体功能的发挥主要依赖于稳定的三维结构，其经典的三维结构包括茎环结构(stem loops)、内环结构(internal loops)、发卡结构(hairpin)、G-四链体结构(G-quadruplex)、假结结构(pseudoknots)及kissing复合体(kissing complexes)等。其中，G-四链体结构特征为：四个鸟嘌呤碱基通过N1、N7、O6、N2原子间产生的Hoogsteen氢键作用而两两连接形成环状平面，此平面称为G-四分体(G-tetrad)，G-四分体是G-四链体的基本结构单元，两个或多个G-四分体以π-π堆叠的形式构成G-四链体。由于生物体内丰富的内源性G-四链体承担着多种重要的生物学功能，因而可形成G-四链体结构的核酸适配体，作为外源性G-四链体分子工具，或通过与某些内源性G-四链体竞争性或非竞争性结合靶标而达到特定的调控效果，或利用其对靶标的高特异性识别能力而成为非常灵敏的检测手段，在疾病的治疗、诊断及细胞内分子调控工具的开发方面具有十分广阔的应用前景。

部分在研究中的G-四链适配体已表现出一定的抗肿瘤活性，但其对多药耐药肿瘤的作用效果还未得到广泛证实，而多药耐药的产生是导致肿瘤化疗失败进而导致患者死亡的主要原因，约半数以上的肿瘤细胞在治疗过程中产生抗药性，导致患者生存期降低并承受大剂量化疗药物产生的副反应。因而将G-四链适配体运用到多药耐药肿瘤治疗中具有重大意义。将G-四链核酸适配体开发为可在生物体内高效发挥抗多药耐药肿瘤作用的理想药物，应满足以下要求：(1)在体内高度稳定，能抵抗各种核酸酶的降解；(2)可高效跨膜入胞，到达靶标所在区域；(3)对靶标具有高度的特异性和亲和性。因此，合理的SELEX后化学修饰、序列改造及包载递送策略对其开发具有十分重要的意义。目前常用于G-四链核酸适配体的化学修饰手段包括糖环修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰、末端修饰等，并且也有各种序列改造方法被开发出来；另一方面，阳离子聚合物及中性核苷脂材经验证均可用于G-四链核酸适配体的包载递送。然而，单一的优化方法往往不足以彻底解决G-四链核酸适配体在生物体内应用所面对的难题，因此，结合数种优化方法的综合修饰方法更具应用前景。

发明内容

为了克服G-四链核酸适配体在生物体内应用中的诸多不足，本发明提供了一种G-四链核酸适配体综合综合化学修饰方法，包括对核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T/U)、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，将该修饰方法应用于具有抗肿瘤效果的G-四链适配体TBA、AS1411，所获得的产品对多药耐药肿瘤具有显著的抑制效果，在多药耐药肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。此修饰方法可广泛应用于各类G-四链核酸适配体中，为其作为药物、检测试剂及细胞内分子调控工具的开发提供新思路。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：