[发明专利]一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用。所述外泌体疫苗是使M1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原Ag，然后提取携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞的外泌体，即得到外泌体疫苗M1_Ag‑Exos。本发明构建了可调节肿瘤免疫微环境的外泌体疫苗增强免疫治疗效率，利用M1型巨噬细胞外泌体实现了肿瘤相关巨噬细胞的极化以及肿瘤疫苗显著的免疫激活作用。本发明通过极化肿瘤相关巨噬细胞为M1型，在使巨噬细胞由免疫抑制促进肿瘤侵袭转移的状态转变为免疫支持抗肿瘤的状态。与此同时，通过对肿瘤微环境的免疫调节，肿瘤疫苗可以更高效率地促进T细胞的增殖和活化，有效抑制肿瘤的生长和转移。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗药物技术领域，具体地说是一种M1型巨噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗具有突出的优势和良好的治疗效果。但在肿瘤的发展过程中，逐渐形成了免疫抑制的肿瘤微环境。TME主要由血管、免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质以及细胞因子生长因子等可溶性因子组成。肿瘤细胞的免疫原性差、效应T细胞功能的抑制和肿瘤微环境浸润的大量免疫抑制细胞这三大主要因素造成了TME的免疫抑制，这一现象严重制约了免疫治疗的效果。巨噬细胞是免疫抑制细胞的主要组成部分，也是免疫抑制的一个重要影响因素。TAM分为两种功能截然不同的表型。M1型巨噬细胞促进抗原呈递和Th1激活，分泌促炎细胞因子和免疫激活因子，以促进抗肿瘤功能。而M2型巨噬细胞通过分泌免疫抑制性细胞因子以及趋化因子，选择性募集T细胞来抑制抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤的侵袭、生长和转移。受肿瘤微环境的影响TAM大多表现为M2型的功能，所以将TAM极化为M1型可以十分有效的逆转肿瘤的免疫抑制，大大提高T细胞激活效率，显著增强肿瘤免疫治疗效果。

巨噬细胞可塑性高，可通过多种方式极化为M1型。在体外，常采用LPS或IFN-γ实现对巨噬细胞的有效极化。在体内则往往利用纳米体系通过多种多样的方式来实现TAM的极化。首先，IL-12作为典型的M1型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子，具有极化巨噬细胞为M1型的能力，但由于单独给药IL-12不稳定并带来全身副作用，Wang等人设计并合成了微环境相应的纳米颗粒作为细胞因子递送系统将IL-12递送到TME释放并极化TAM来实现肿瘤治疗中微环境的免疫调节；而Cheng等人更是将编码IL-12基因的质粒DNA递送至TME实现巨噬细胞的极化。此外，一些无机纳米粒子如Fe₃O₄也能有效极化巨噬细胞为M1型，这可能与这些材料在肿瘤微环境发生芬顿反应或类芬顿反应产生ROS有关。而以R848为代表的TLR7和TLR8的双受体激动剂对巨噬细胞的极化也有很大的影响，Weissleder等人通过β环糊精负载R848在多种小鼠肿瘤模型中证明了肿瘤免疫微环境中巨噬细胞向M1表型改变。

从机制上来看，一些信号通路的激活或抑制会对巨噬细胞的表型产生影响。例如在对近期临床上显示出抗肿瘤作用的抗疟药氯喹进行研究时发现，氯喹是通过激活NF-κB信号通路使TAM极化为M1型巨噬细胞从而显示出抗肿瘤的活力。Chen等人和Zhang等人分别通过MnO₂纳米粒子的构建以及Ndrg2基因的敲除来激活NF-κB信号通路，也同样实现了巨噬细胞向M1型的极化。而CSF1R、MAPK和STAT3信号通路的抑制才会使巨噬细胞向M1型极化。除此以外，micRNA也会对巨噬细胞的表型产生影响。突变型p53癌症可以通过外泌体中miR-1246将巨噬细胞重编程为支持肿瘤的状态。miR155可用于上调TAM中IL-12、iNOS以及MHCII的表达，以及miR-125b将巨噬细胞重新极化为免疫激活表型来增强紫杉醇的抗肿瘤效果。此外，Kim等人在对巨噬细胞囊泡的研究中也提到miR-155、miR-125和miR-21可将巨噬细胞极化为M1表型，而miR-34a、let-7c以及let-7f则可以将巨噬细胞极化为M2表型。

TAM在体内的极化常常借助纳米载体来完成，而外源性的材料作为载体通常会存在免疫原性高、有潜在的毒副作用等缺点。因此，急需研制一种毒副作用小、效果好的疫苗，将肿瘤相关巨噬细胞极化为M1型，从而使巨噬细胞由免疫抑制促进肿瘤侵袭转移的状态转变为免疫支持抗肿瘤的状态。

发明内容