[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法

权利要求书

1.一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，构建病原真菌序列参考库：

1-1，利用多个数据库的微生物rRNA序列，构建病原真菌序列参考库，通过自开发python脚本判断序列的来源出处，对重复出现的参考序列进行过滤，形成高可信度的病原真菌序列参考库；

1-2，再将病原真菌的序列根据种属进行分类建库，搜索分流提速；

步骤二：鉴定病原真菌：

通过测序数据样品拆分、数据质控处理、比对分析和物种分类对测序数据进行分析；

2-1，所述测序数据样品拆分的内容包括：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，fastq文件中每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段barcode序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，并正确分辨每一条barcode序列对应的样品；

2-2，所述数据质控处理的具体内容包括：采用NanoFilt软件并根据序列的平均测序数据质量值Q进行质控，若Q值小于7的序列为不合格序列，则被去除；

2-3，所述比对分析的具体内容为：将质控处理后的序列采用blast、minimap2与病原真菌参考库中的参考序列进行比对，计算reads 的identity和coverage，筛选coverage大于80%、identity 大于85%作为比对质量高的结果；

2-4，所述物种分类的具体内容包括如下步骤：

步骤a:将序列与病原真菌序列参考库进行比对，选择比对分数最高、coverage大于80%且identity大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录ID；

步骤b: 根据物种谱系数据库中最佳比对参考序列ID及对应的物种谱系信息，获取物种分类结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的多个数据库包括：18S rRNA、ITS 、SILVA和UNITE。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的分类建库的具体方法是：将病原真菌序列分为常见病原真菌和非常见病原真菌分别进行建库；序列优先与常见病原真菌数据库进行比对，若无检索结果则继续在非常见病原真菌库进行比对；所述常见病原真菌库包括：念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌属、镰刀菌属、球孢子菌属、孢子丝菌属和芽生菌属；所述非常见病原真菌库包括霉菌属、丝孢菌属和酵母菌属。

4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中对重复出现的参考序列进行过滤的具体步骤为：

所述步骤一中对重复出现的参考序列进行过滤的具体步骤为：

步骤a：将来源不同的序列合并成一个综合数据库，并剔除重复序列；

步骤b：筛选有文献支持的序列作为高可信度参考序列。

5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中，计算identity和coverage的方法为：minimap2比对结果中第13列含有前缀de:f:，该列值加上identity等于1；minimap2比对结果第2列代表序列长度，第3列代表比对其实位置，第4列代表比对终止位置，将第4列与第3列的差值除以第2列等于coverage。

6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中病原真菌序列参考库为NCBI taxonomy。

7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中物种分类结果分为界、门、纲、目、科、属、种这7个层次进行物种判定。