[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，属于分子生物领域，包括如下步骤：先构建病原真菌序列参考库，再通过测序数据样品拆分、数据质控处理、比对分析和物种分类对测序数据进行分析鉴定病原真菌；本发明的鉴定方法具有KB级的测序长度，可有效提升病原真菌物种分辨率从而保证鉴定结果的准确性，且提升病原真菌序列检索速度。

技术领域

本发明涉及分子生物领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法。

背景技术

被感染后进行治疗的首要条件就是要快速准确的对病因进行鉴定。尽可能的进行早期诊断和早期药物干预能够尽可能的提高生存率。而对病原真菌的快速、准确的检测能够在第一时间进行诊断并给出相应的治疗药物。

目前的病原真菌检测技术分为基于分离培养和镜检的检测技术、定量PCR检测技术和基于高通量宏基因组测序的检测技术。基于分离培养和镜检的检测技术有诸多的不足，如厌氧菌离体后容易死亡；ICU分离菌株抗生素暴露后，低活性状态难以生长；部分菌落生长极其缓慢或快速难以分离；复合感染等问题，基于定量PCR的检测技术检测范围有限，同时特异性和通量低。基于高通量宏基因组测序的检测技术可实现对所有病原真菌无选择性、无偏倚、快速、全面的检测，但同样存在许多的限制。检测样本中的微生物DNA和宿主DNA极易受到干扰。测序结果需要样本完全测序完成后才可进行生信分析进行。

纳米孔测序是一种单分子、实时测序的新一代测序方法，其以单分子DNA（RNA）通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。纳米孔测序测序具有长度长、实时测序、按需测序以及灵活、可扩展等特点。相比细菌和病毒，真菌的序列长的多；在序列比对检索过程中，真菌序列检索需要更多的时间，尤其是待检索真菌序列数量庞大的时候。

市场需要一种能够进一步提升病原真菌序列检索速度的测序数据鉴定方法，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，本发明的鉴定方法具有KB级的测序长度，可有效提升病原真菌物种分辨率从而保证鉴定结果的准确性，且提升病原真菌序列检索速度。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于纳米孔测序仪的真菌测序数据鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，构建病原真菌序列参考库：

1-1，利用多个数据库的微生物rRNA序列，构建病原真菌序列参考库，通过自开发python脚本判断序列的来源出处，对重复出现的参考序列进行过滤，形成高可信度的病原真菌序列参考库；

1-2，再将病原真菌的序列根据种属进行分类建库，搜索分流提速；

步骤二：鉴定病原真菌：

通过测序数据样品拆分、数据质控处理、比对分析和物种分类对测序数据进行分析；

2-1，测序数据样品拆分的内容包括：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，fastq文件中每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段barcode序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，并正确分辨每一条barcode序列对应的样品；

2-2，数据质控处理的具体内容包括：采用NanoFilt软件并根据序列的平均测序数据质量值Q进行质控，若Q值小于7的序列为不合格序列，则被去除；

2-3，比对分析的具体内容为：将质控处理后的序列采用blast、minimap2与病原真菌参考库中的参考序列进行比对，计算reads 的identity和coverage，筛选coverage大于80%、identity 大于85%作为比对质量高的结果；

2-4，物种分类的具体内容包括如下步骤：

步骤a：将序列与病原真菌序列参考库进行比对，选择比对分数最高、coverage大于80%且identity大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录ID；