[发明专利]一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法，属于DNA重组技术领域。本发明公开的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体，通过将丝状噬菌体PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223‑3的多克隆位点上制备得到。本发明制备的噬菌粒载体pKK8在展示外源肽方面具有操作简单、可用于相对较长外源多肽的展示等优点，降低噬菌体展示技术的操作要求，可进一步推动噬菌体展示技术在医学、生物学、材料学等学科的交叉应用研究。

技术领域

本发明涉及DNA重组技术领域，更具体的说是涉及一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法。

背景技术

噬菌体展示技术是在基因水平上，以噬菌体载体或噬菌粒载体为模板，将编码外源肽的基因序列定向插入到外壳蛋白基因中，进而使外源多肽展示在噬菌体外壳蛋白上。1985年，Smith首次在Science上报道了将核酸内切酶基因克隆到丝状噬菌体的外壳蛋白基因III中，并成功将酶分子展示在噬菌体的PIII蛋白上，之后该技术迅速发展并广泛应用到各个领域中，并获得2018年诺贝尔化学奖。

丝状噬菌体展示技术主要与两种外壳蛋白有关，一种是由基因III编码的PIII蛋白，位于噬菌体的尾端，5个拷贝，该外壳蛋白最突出的优点是对展示的外源肽的大小无严格限制，但拷贝数相对较少，常用于抗体库的构建等方面；另一种是由基因VIII编码的PVIII蛋白，位于噬菌体的背部，大约有2700个拷贝，该展示系统能够以多价的形式将外源肽展示在噬菌体的表面，在无佐剂辅助的情况下刺激机体针对展示的外源肽产生强烈的免疫应答反应，但该系统对展示的外源肽的大小有限制。

噬菌体载体是直接以噬菌体的基因组为模板而构建的载体，通过将外源肽定向插入到噬菌体的PIII或PVIII基因中，进而使外源肽展示在噬菌体的表面，但噬菌体载体在制备纯化方面相对较繁琐，且产量较低，对操作要求相对较高。同时对于PVIII展示系统，由于VIII蛋白只有50个氨基酸，直接利用噬菌体基因组进行展示通常只能插入较短的肽(一般不宜超过6个氨基酸)，否则会影响噬菌体的组装，降低噬菌体的侵染能力。

因此，提供一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法，制备的噬菌粒载体pKK8在展示外源肽方面具有操作简单、可用于相对较长外源多肽的展示等优点，能够进一步拓宽噬菌体展示技术应用范围。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体，将丝状噬菌体PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223-3的多克隆位点上，制备得到噬菌粒载体pKK8。

进一步，一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)将原核表达载体pKK223-3用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的载体pKK223-3；

(2)以载体fADL-le为模板，利用引物PF1/PR1 PCR扩增PVIII基因；并用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的PVIII基因目的片段；

(3)将步骤(1)获得的酶切后的载体pKK223-3与步骤(2)获得的酶切后的PVIII基因目的片段进行连接，转化，筛选阳性克隆，获得噬菌粒载体pKK8。

进一步，步骤(2)所述引物PF1/PR1的引物序列如下：

PF1：5’-TTCCGGAATTCGTAGTGGCATTACG-3’；SEQ ID NO.2；