[发明专利]一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法

权利要求书

1.一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

①将诱导多能干细胞消化、重悬，得到单散细胞；

②将步骤①所得单散细胞接种至U/V型低粘附培养材料上，添加视网膜神经祖细胞培养液，悬浮培养，得到诱导多能干细胞自组装形成的细胞球；

③将步骤②所得细胞球转移至平底低粘附培养板上，添加RPE细胞分化诱导液，继续悬浮培养，得到未成熟视网膜色素上皮细胞形成的细胞球；

④将步骤③所得细胞球转移至新的平底低粘附培养板上，添加RPE细胞成熟分化液，继续悬浮培养，得到单层视网膜色素上皮细胞形成的空心细胞球；

⑤将步骤④所得空心细胞球剪开、平铺，获得所述的无支架视网膜色素上皮细胞片。

2.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤②中，视网膜神经祖细胞培养液是含有体积百分比10％的血清替代物，体积百分比1％的脂质浓缩物，体积百分比1％的青链霉素混合液，450μmol/L的硫代甘油的Ham’s F12培养液。

3.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤③中，RPE细胞分化诱导液是含有体积百分比1％的N2细胞培养添加剂，体积百分比1％的青链霉素混合液的DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤④中，RPE细胞成熟分化液是含有体积百分比1％的N2细胞培养添加剂，体积百分比1％的青链霉素混合液，体积百分比1％的胎牛血清的DMEM/F12-Glutamax培养基。

5.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤②中，悬浮培养的时间为15～20天，培养至第5～7天时添加BMP4人源重组蛋白；所述BMP4人源重组蛋白的添加量按50～60ng/mL计；

所述步骤③中，悬浮培养的时间为5～10天，培养至第18～24天时添加CHIR99021和SU54026；所述CHIR99021的添加量按其在体系中的终浓度为2～4μmol/L计，所述SU5402的添加量按其在体系中的终浓度为4～6μmol/L计；

所述步骤④中，悬浮培养的时间为8～15天，培养至第24～34天时添加CHIR99021；所述CHIR99021的添加量按其在体系中的终浓度为2～4μmol/L计。

6.根据权利要求5所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤②中，悬浮培养的时间为18天，培养至第6天时添加BMP4人源重组蛋白；所述BMP4人源重组蛋白的添加量按55ng/mL计；

所述步骤③中，悬浮培养的时间为6天，培养至第18天时添加CHIR99021和SU54026；所述CHIR99021的添加量按其在体系中的终浓度为3μmol/L计，所述SU5402的添加量按其在体系中的终浓度为5μmol/L计；

所述步骤④中，悬浮培养的时间为10天，培养至第24天时添加CHIR99021；所述CHIR99021的添加量按其在体系中的终浓度为3μmol/L计。

7.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤①中，消化所用的试剂为0.4～0.6mmol/L的乙二胺四乙酸溶液；

所述步骤①中，重悬所用的试剂为视网膜神经祖细胞培养液。

8.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤②中，接种的接种量按1×10⁵～2×10⁵细胞/mL培养液计。

9.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤②、步骤③、步骤④中，悬浮培养均在37℃二氧化碳培养箱内进行，培养过程中每2天半量换新鲜培养液。

10.根据权利要求1所述的无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，其特征在于：

所述步骤①中，诱导多能干细胞为人诱导多能干细胞。