[发明专利]一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法

说明书

本发明提供了一种三维悬浮培养多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法属于生物科技技术领域。本发明方法包括如下步骤：将人诱导多能干细胞消化、重悬，得到单散细胞；将单散细胞接种至U/V型低粘附培养材料上，依次用视网膜神经祖细胞培养液、RPE细胞分化诱导液、RPE细胞成熟分化液悬浮培养，得到单层视网膜色素上皮细胞形成的空心细胞球；所得空心细胞球剪开、平铺，即可获得无支架视网膜色素上皮细胞片。本发明方法所得RPE细胞片具有曲率，并携带有与RPE细胞一同分化而来的基底膜组织，未来应用于临床移植时无需外源支架材料，可避免免疫排斥反应。本发明方法可操作性好，诱导过程简单，重复性高，便于未来临床的精准应用。

技术领域

本发明属于生物科技技术领域，特别涉及一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法。

背景技术

视网膜是位于眼球壁内部的一层透明薄膜结构，其位于脉络膜的内面，可分为10层结构，由外到内依次为视网膜色素上皮层、感光层、外界膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。其中视网膜色素上皮细胞(RPE)是紧贴视网膜神经细胞的一层排列规则的呈多角形样的黑色素细胞。RPE细胞不能再生，一旦因疾病或损伤造成RPE细胞死亡，则只能通过细胞移植治疗。但是供体RPE细胞来源非常有限，且RPE细胞成片移植需要外源性材料的支撑，容易造成免疫排斥和并发症问题。

诱导多能干细胞(iPSCs)是一种由成体细胞经转入转录因子重编程去分化形成的多能干细胞。由于具有强大的自我更新能力以及分化潜力，iPSCs成为视网膜疾病建模和治疗的有利工具。经分离患者皮肤、血液或尿液等来源的体细胞，可重新编程为iPSCs，然后分化为视网膜类型细胞，用于患者自体移植治疗视网膜疾病或建立个体化疾病模型，从而实现对疾病的精准治疗和机理探索。

类器官是源自诱导多能干细胞或胚胎干细胞的细胞分化聚集体，其可以概括机体器官的结构、功能及遗传特性，是研究和理解器官发育及疾病发生发展的有利工具。因此，视网膜类器官在视网膜疾病的建模、药物筛选、细胞治疗和基因编辑等方面具有重要应用价值。2011年Sasai等人利用胚胎干细胞在体外特定分化条件下模拟机体视网膜发育过程而培养得到的视杯状结构组织，发现胚胎干细胞可以在含有基质胶的培养液中自组装为呈极性分布的神经上皮组织，然后形成原始视网膜组织的芽泡结构，极为类似机体视网膜发育的视泡结构，紧接着芽泡组织结构发生外翻或内凹进而形成视杯状结构，由此分化而来的视网膜色素层和神经上皮层均分布在相对应的位置，且具备生物学特性。2013年钟秀凤等人发现人源诱导多能干细胞能够分化产生视网膜类器官，其可进一步分化发育出具有完整内外节结构的光感受器和可分泌黑色素的RPE细胞。

综上所述，通过iPSCs体外制备RPE细胞的方法仍有待改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法。该方法通过三维悬浮培养视网膜类器官技术诱导多能干细胞分化为色素上皮细胞，为自体化可移植RPE细胞片提供了新的来源途径，且该RPE细胞片无需外源支架材料，提高了临床RPE细胞移植的安全性和有效性，解决了现有技术因支架材料形成的RPE细胞片移植所带来的安全隐患问题，为利用RPE细胞片移植治疗RPE缺损型眼病提供新的技术方案。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法，包括以下步骤：

①将诱导多能干细胞消化、重悬，得到单散细胞；

②将步骤①所得单散细胞接种至U/V型低粘附培养材料上，添加视网膜神经祖细胞培养液，悬浮培养，得到诱导多能干细胞自组装形成的细胞球；

③将步骤②所得细胞球转移至平底低粘附培养板上，添加RPE细胞分化诱导液，继续悬浮培养，得到未成熟视网膜色素上皮细胞形成的细胞球；