[发明专利]一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法

权利要求书

1.一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，所述龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法包括以下步骤：

步骤一，进行R-型藻红蛋白粗提液的获取：选取大型经济海洋红藻龙须菜作为藻红蛋白分离纯化的原料；将冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜剪碎，浸泡灭菌蒸馏水中，经过冻结融解2～3次后，搅拌，并进行超声波破碎处理；将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中浸提，纱布过滤，离心，收集上清液，即可得到R-型藻红蛋白粗提液；

在对大型经济海洋红藻龙须菜剪碎后，将-20℃条件下冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现红藻细胞的破壁；

步骤二，利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理：将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，根据饱和度进行分级沉淀，并静置12～24h；静置后于4℃、12000～15000rpm/min的条件下离心20～30min，收集沉淀；取沉淀溶于灭菌蒸馏水并置于透析袋中进行蒸馏水透析，除去硫酸铵，并将透析后的样品离心，收集上清液；超滤膜过滤，即可得到经盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；

所述根据饱和度进行分级沉淀，包括：

将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，于饱和度分别为20％、40％、和60％时进行分级沉淀；

步骤三，利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化：获取盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；利用离子交换层析技术将盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液进行强阴离子CaptoTM Q层析柱纯化；纯化后，利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理，得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白；

利用离子交换层析技术进行层析处理时，用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液的pH为8.0～8.5，清洗缓冲液中Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、EDTA溶液浓度为4.0～6.0mmol/L。

2.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述PBS缓冲液的体积为所述大型经济海洋红藻龙须菜体积的10～30倍，所述PBS缓冲液浓度为70mmol/L，pH 6.0～7.0。

3.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述浸提的条件为：将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中，于4℃条件下，浸提24～48h。

4.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述离心的方法为：将滤液置于8000～16000rpm/min的条件下离心15～20min。

5.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，进行超声波破碎处理时，超声波破碎仪以30％～40％的输出功率破碎细胞4～5min，每破碎3～5s间隔停顿3～5s。

6.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，所述将透析后的样品离心的条件为：将透析后的样品置于高速冷冻离心机中，于4℃、6000～8000rpm/min的条件下离心20～25min。

7.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，所述利用超滤膜进行过滤，包括：

利用30～40kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30～40kDa的杂蛋白。

8.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述强阴离子CaptoTM Q层析柱的规格为：1.5×20cm，柱床高度5～10cm，平衡和洗脱的流速均为0.6～1.2mL/min，洗脱总体积为400～500mL。