[发明专利]一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法

说明书

本发明属于红藻分离纯化技术领域，公开了一种龙须菜试剂级R‑型藻红蛋白的高效分离纯化方法，包括：进行R‑型藻红蛋白粗提液的获取；利用硫酸铵沉淀法进行R‑型藻红蛋白粗提液的盐析处理；利用强阴离子交换柱层析进行R‑型藻红蛋白的分离纯化。本发明操作简单，回收率高，纯度高并达到试剂级要求，大大降低生产成本，为试剂级R‑型藻红蛋白应用于医学检测、生物技术等领域奠定了基础；提供的R‑型藻红蛋白经过CaptoTM Q离子交换柱层析一步纯化，纯度达到A₅₆₆/A₂₈₀＝5.37；采用CaptoTM Q离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率高等特点，A₅₆₆/A₂₈₀达到5.0以上。

技术领域

本发明属于红藻分离纯化技术领域，尤其涉及一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。

背景技术

目前，藻红蛋白在不同领域应用时对其纯度(Aλmax/A₂₈₀)要求不同，一般纯度大于0.7是食品级，大于3.0是医药级，大于3.9是反应级，试剂级大于4.0。藻红蛋白在不同领域中应用时，因其纯度要求不同，所以藻红蛋白的价格也不尽相同。Cyanotech公司生产的R-藻红蛋白价格＄3.25-14/mg，Martek公司生产的山羊抗鼠IgG：R-藻红蛋白的价格高达＄165/mg。

现有藻红蛋白分离纯化方法是通过数次的羟基磷灰石柱层析结合离子交换层析或凝胶过滤层析来进行，以往的提纯方法在实际工业化生产过程中存在操作步骤复杂，动力能耗高以及操作周期长等缺点；据文献报道，分离纯化的成本占产品成本的50～90％；此外，由于步骤过多而导致产量损失大，通常每增加一步层析过程目标蛋白就会减少20％，这对工业化生产来说成本无疑是十分昂贵的。因此，一种高效、经济且易于放大的分离纯化方法对于生产高纯度和高回收率的藻红蛋白来说是十分必要的。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有藻红蛋白分离纯化方法存在操作步骤复杂，动力能耗高以及操作周期长等缺点，且由于步骤过多会导致产量损失大。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。

本发明是这样实现的，一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，所述龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法包括以下步骤：

步骤一，进行R-型藻红蛋白粗提液的获取：选取大型经济海洋红藻龙须菜作为藻红蛋白分离纯化的原料；将冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜溶于灭菌蒸馏水中，经过冻结融解2～3h后，搅拌，并进行超声波破碎处理；将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中浸提，纱布过滤，离心，收集上清液，即可得到R-型藻红蛋白粗提液；

在对大型经济海洋红藻龙须菜剪碎时，将-20℃条件下冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；

步骤二，利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理：将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，根据饱和度进行分级沉淀，并静置12～24h；静置后于4℃、12000～15000rpm/min的条件下离心20～30min，收集上清液和沉淀；取沉淀溶于灭菌蒸馏水并置于透析袋中进行蒸馏水透析，除去硫酸铵，并将透析后的样品离心，收集上清液；超滤膜过滤，即可得到经盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；

所述根据饱和度进行分级沉淀，包括：

将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，于饱和度分别为20％、40％、和60％时进行分级沉淀；