[发明专利]7种耐药基因多重PCR检测的引物、探针及其试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及7种耐药基因多重PCR检测的引物、探针及其试剂盒。本发明可快速、准确及超高灵敏度地对耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM、OXA48基因，耐甲氧西林的葡萄球菌mecA基因和耐万古霉素的多重耐药的肠球菌中vanA基因进行联合检测，可实时、快速监测血流感染患者体内的特定耐药基因的变化，及时评估患者状况，为临床医生提供辅助治疗建议。本发明试剂盒亦可用于危重症患者和免疫抑制人群无症状定植者的CRE、MRSA和VRE中7种细菌耐药基因的主动筛查，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及7种耐药基因多重PCR检测的引 物、探针及其试剂盒。

背景技术

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅 速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素 滥用情况最为严重的国家之一，然而随着抗生素使用量的增加，细菌耐药情 况也越发严重。当前，细菌耐药性的监测/检测重点包括：1、耐碳青霉烯类药 物的肠杆菌科细菌(CRE)；2、耐甲氧西林的葡萄球菌(MRSA)；3、耐万古 霉素的多重耐药的肠球菌(VRE)。

碳青霉烯类抗生素对大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌感染均有强大 的抗菌效果，是临床上抵御严重细菌感染的重要屏障。但是随着碳青霉烯类 抗菌药物的大量使用，国内外开始报道对碳青霉烯类抗菌药物不敏感甚至耐 药的肠杆菌科细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用。革兰氏阴 性菌对碳青霉烯耐药最主要的机制是产生碳青霉烯酶，按照Ambler分子分类 方法，碳青霉烯酶可分为A、B和D三类，A类以blaKPC为主，B类为金属 β-内酰胺酶，以blaNDM、blaIMP和blaVIM为主，D类为OXA-48型丝氨酸 碳青霉烯酶。我国临床分离的CRE菌株产生碳青霉烯酶以KPC和NDM型为 主，少数菌株产生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶。编码碳青霉烯酶基 因由质粒介导，细菌一般产单一碳青霉烯酶，少数细菌会产碳青霉烯酶复合 酶。CHINET中国细菌耐药监测网对2018年收集自全国39所医院935株CRE 菌株的研究结果显示，产KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶菌株所占比例 分别为51.6％(482/935)、35.7％(334/935)和7.3％(68/935)。头孢他啶/阿 维巴坦，对于产KPC-2肠杆菌科细菌感染有良好的效果，但对于金属酶无效。

在过去的10多年里，革兰氏阳性球菌感染所占比例逐渐增加，同时革兰 氏阳性球菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重，其中耐甲氧西林葡萄球菌 (MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)在临床上分离率高，所致感染治疗困 难，是当前最受关注的耐药革兰氏阳性球菌。青霉素结合蛋白(Penicillin-bindingprotein 2a,PBP2a)是MRSA耐药性产生的主要原因， 这种蛋白质对β-内酰胺类抗菌药物的亲和力很低，而mecA基因是调节编码 PBP2a最关键的基因，mecA基因主要存在于金黄色葡萄球菌染色体mec 基因盒上。耐万古霉素肠球菌(VRE)的耐药机制主要是由于肠球菌获得了 vanA、vanB、vanC、vanD、vanE等耐药基因后，细胞壁的生物合成途径发生 了改变，使其合成的肽聚糖前体与万古霉素等糖肽类抗生素亲和力下降，从 而导致肠球菌对万古霉素耐药，通常以vanA、vanB两型较为多见，故最具临床意义。