[发明专利]一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒和应用

权利要求书

1.一种循环神经细胞的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、富集目标细胞：外周血进行细胞富集后，加入到可寻址微孔阵列芯片的微孔内，得到富集细胞；

步骤2、筛选细胞：在所述可寻址微孔阵列芯片上对步骤1得到的富集细胞进行荧光标记的第一抗体物质染色，所述第一抗体物质为白细胞共同抗原CD45和葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，并进行第一次细胞清洗及成像，得到第一成像细胞；筛选出表达所述葡萄糖代谢性标志物2-NBDG而不表达所述白细胞共同抗原CD45的细胞，即2-NBDG⁺/CD45^-的细胞，为具有活性的所述循环神经细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括密度梯度离心法或免疫磁珠法，其中所述密度梯度离心法的步骤为：

步骤1.1、将所述外周血与循环肿瘤细胞(CTC)富集的抗体室温孵育20分钟，得到第一孵育液；所述CTC富集的抗体包含CD36抗体；

步骤1.2、将含有2％胎牛血清(FBS)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)缓冲液加入到步骤1.1获得的第一孵育液中，充分混匀，得到混合液；

步骤1.3、将淋巴细胞分离液通过第一离心管中间的小孔加入到所述第一离心管的底部，所述第一离心管为密度梯度离心管；

步骤1.4、将步骤1.2获得的混合液沿着管壁转移到步骤1.3中的所述密度梯度离心管中；并在配平的前提下，1200g离心，得到第一离心液；

步骤1.5、将步骤1.4获得的第一离心液中的上层液体转移到第二离心管中，并在配平的前提下，600g离心，得到第二离心液；

步骤1.6、步骤1.5获得的第二离心液中，弃上清，并加入红细胞裂解液，室温孵育，并300g离心，得到第三离心液；

步骤1.7、步骤1.6获得的第三离心液中，弃所述上清，将下层液体重悬并转移到预先用3％BSA封闭的所述可寻址微孔阵列芯片中，所述下层液体含有细胞；

所述免疫磁珠法的步骤为：在所述外周血中加入10倍体积的所述红细胞裂解液，室温避光裂解后，300g离心5分钟；离心后弃所述上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬细胞后，300g离心5分钟；离心后弃所述上清，加入1毫升所述HBSS缓冲液重悬细胞后，取少量细胞悬液进行细胞计数；基于所述细胞计数按照相应比例加入CD45-别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)抗体，充分混匀后，避光室温孵育1小时；进行连续两次重复离心和重悬处理，具体为：300g离心5分钟，弃上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬后，300g离心5分钟，再弃所述上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬；之后加入0.2毫升所述HBSS缓冲液重悬，得到细胞悬液；按照一定比例加入修饰有CD45抗体的免疫磁球入所述细胞悬液，并充分混匀，避光孵育15分钟；孵育结束后，加入0.8毫升所述HBSS缓冲液充分混匀后，放置在磁力架上静置10分钟，待所有结合有所述免疫磁球的细胞被吸附在所述磁力架一侧后，将含后候选细胞的所述细胞悬液吸取到一个新的离心管中；300g离心5分钟，吸弃900微升所述上清后，将剩余100微升含有细胞的液体重悬并转移到预先用3％所述BSA封闭的所述可寻址微孔阵列芯片中；

所述步骤2中所述荧光标记的第一抗体物质包括由荧光素或量子点直接标记的所述第一抗体物质，或者由非标记的一抗与所述荧光素或量子点标记的二抗形成的第一组合。